دانشگاه آزاد اسلامي
واحد شاهرود
دانشکده فني مهندسي گروه مهندسي شيمي
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد “M.Sc.”
گرايش: بيوتکنولوژي
عنوان:
مقايسه خصوصيات سينتيکي آنزيم ليپاز آزاد و تثبيت شده روي نانو ذره کيتوسان
استاد راهنما:
جناب آقاي پروفسور سليمان محجوب
استاد مشاور:
سرکار خانم دکتر آرزو قادي
نگارش:
سميرا کلانتري
شهريور 92
ISLAMIC AZAD UNIVERSITY
Science and Research Branch
Faculty of Science- Department of Engineering
“M.Sc” Tesis
Subject:
Comparison of Kinetic Charachteristics of Free and Immobilized Lipases on Nano Chitosan Particle
Supervisor:
Prof. Soleiman Mahjoub
Consulting Advisor:
Dr.Arezoo Ghadi
By:
Samira Kalantari
Summer 2013
شکر و سپاس از خداوند مهربان که بزرگترين اميد و ياور در لحظه لحظه زندگيست.
سپاس گذاري از زحمات بي دريغ اساتيد گرانقدرم هرگز به حد کفايت نخواهد رسيد. به حکم وظيفه از زحمات ارزشمند همه معلماني که رنج آموختن به من را متحمل شدندو تو فيق کسب علم و دانش در محضرشان را به بنده ارزاني داشته اند ، صميمانه تشکر مينمايم و از خداوند متعال براي ايشان توفيق روز افزون مسئلت مينمايم.
از استاد ارجمندم جناب آقاي پرفسور سليمان محجوب به خاطر فرصت گرانبهاي ايشان و راهنمايي هاي ارزشمندشان و همچنين به خاطر انتقال تجارب گرانقدرشان به اين جانب در طول تحصيل کمال تشکر و قدر داني را دارم.
و نيز برخود لازم و واجب ميدانم از زحمات و کمک هاي دلسوزانه ي استاد بزرگوار و عزيزم سرکار خانم دکتر آرزو قادي کمال سپاس و قدرداني را داشته باشم.
تقديم به مهربان فرشتگاني که:
لحظات ناب باور بودن، لذت و غرور دانستن، جسارت خواستن، عظمت رسيدن و تمام تجربه هاي يکتا و زيباي زندگيم، مديون حضور سبز آنهاست ، به پدر و مادر عزيزم…. که نه ميتوانم موهايشان را که در راه عزت من سفيد شد، سياه کنم و نه براي دستهاي پينه بسته شان که ثمره تلاش براي افتخار من است، مرهمي دارم . پس توفيقم ده که هر لحظه شکر گزارشان باشم و ثانيه هاي عمرم را در عصاي دست بودنشان بگذرانم.
پيشکش به برادر عزيزم که:
همواره در طول تحصيل متحمل زحماتم بود و تکيه گاه من در مواجهه با مشکلات، و وجودش مايه دلگرمي من مي باشد.
به خواهران مهربانم که:
وجودشان شادي بخش و صفايشان مايه آرامش من است که شايسته ي تحسين و عشق ورزيدن هستند و فرصتهاي گران و ره آورد هاي زندگيم از ايشان است.
فهرست مطالب
عنوانصفحه
چکيده: 1
فصل اول: مقدمات و کليات
1-1-بيان مسئله 3
1-2-اهداف تحقيق 4
1-3-فرضيه هاي تحقيق4
1-4- مفهوم نانوتکنولوژي 5
1-4-1-کاربردهاي نانوتکنولوژي5
1-4-1-1- توليد مواد و محصولات صنعتي5
1-4-1-2- پزشكي و بدن انسان6
1-4-1-3- پايداري منابع6
1-4-1-4- صنايع غذايي6
1-5-آنزيم ها8
1-5-1-خصوصيات آنزيم ها8
1-5-2- خصوصيات واکنشهاي آنزيمي11
1-5-3- پارامترهاي موثر بر واکنشهاي آنزيمي14
1-5-3-1- دما14
1-5-3-2-pH 14
1-5-3-3-بازدارندهها15
1-5-4- سينتيک واکنش آنزيمي16
1-5-5-عوامل موثر برسرعت و فعاليت آنزيمها 17
1-5-5-1-اثر غلظت ماده اوليه برسرعت واکنش آنزيمي17
1-5-6- معادله ميکائيليس- منتن18
1-5-7- معادله لينويور- برک 21
1-5-8- آنزيم ليپاز23
1-5-8-1-كاربرد ليپاز25
1-5-8-2- سينتيک واکنش ليپاز27
1-5-8-3-روش هاي اندازهگيري فعاليت ليپاز28
1-6- تثبيت آنزيم 30
1-6-1- انتخاب پايه و روش مناسب جهت تثبيت آنزيم31
1-7- کيتين و کيتوسان 32
1-7-1- کيتين33
1-7-2- کيتوسان34
1-7-2-1- کاربردهاي کيتوسان35
1-8-تعيين مشخصات نانوذرات کيتوسان 38
فصل دوم: ادبيات و پيشينه تحقيق
2-1-مروري برمطالعات آنزيمي 41
2-2-مروري بر پيشينه آنزيم ليپاز 42
2-3-تاريخچه توليد کيتين و کيتوسان 44
2-4-تاريخچه تثبيت آنزيم روي نانو ذرات 45
2-5-تحقيقات پيشين در اين زمينه 46
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1- مقدمه 51
3-2-مواد شيميايي 52
3-3-وسائل و دستگاه هاي مورد نياز 54
3-3-1-ظروف آزمايشگاهي54
3-3-2-دستگاهها54
3-4-روشهاي آزمايشگاهي بکار گرفته شده در پايان نامه 58
3-4-1-سنتز نانو ذرات کيتوسان 58
3-4-2-تثبيت آنزيم ليپاز به روش اتصال کووالان بر اساس واکنش باز شيف59
3-4-3-تعيين خصوصيات نانو ذره کيتوسان با استفاده از ميکروسکوپ الکتروني روبشي60
3-4-4-تعيين توزيع اندازه ذرات نانوکيتوسان سنتز شده به روش تفرق نور با استفاده از زتاسايزر61
3-4-5-طيف سنجي مادون قرمز(FT-IR) 62
3-4-6- اندازهگيري پروتئين تام به روش برادفورد62
3-4-7-اندازهگيري مقدار پروتئين (ليپاز) تثبيت شده بر روي نانوذره کيتوسان63
3-4-8-اندازهگيري فعاليت آنزيم ليپاز63
3-4-8-1-منحني استاندارد فعاليت ليپاز64
3-4-8-2-روش اول- اندازهگيري فعاليت ليپاز به روش کيت پارس آزمون (کيت تشخيصي کمي Lipase DC) در سرم يا پلاسما به روش فتومتريک66
3-4-8-3-روش دوم- اندازهگيري فعاليت ليپاز با استفاده از سوبستراي پارانيتروفنيل پالميتات (pNPP)68
3-4-9- بررسي اثر دما بر فعاليت آنزيم ليپاز در حالت آزاد و تثبيت شده روي نانو کيتوسان68
3-4-10-بررسي اثر pH بر فعاليت آنزيم ليپاز در حالت آزاد و تثبيت شده روي نانو کيتوسان69
3-4-11-بررسي پارامتر هاي سينتيکي آنزيم ليپاز آزاد و تثبيت شده روي نانو ذره کيتوسان69
فصل چهارم: نتايج
4-1-مقدمه 71
4-2-تصوير برداري ميکروسکوپ الکتروني روبشي (SEM) 71
4-3-طيف سنجي مادون قرمز تبديل فوريه (FT-IR) 72
4-4-توزيع اندازه نانوذرات سنتز شده با استفاده از زتا سايزر 74
4-5-فعاليت ليپاز سودوموناس آزاد و تثبيت شده روي نانوذره کيتوسان 75
4-6-بررسي اثر pH بر فعاليت آنزيم ليپاز سودوموناس آزاد و تثبيت شده روي نانوذره کيتوسان 76
4-7-مقايسه درصد فعاليت نسبي آنزيم ليپاز آزاد و تثبيت شده در pH هاي مختلف 77
4-8-بررسي اثر دما بر فعاليت آنزيم ليپاز سودوموناس آزاد و تثبيت شده روي نانو ذره کيتوسان 78
4-9-مقايسه درصد فعاليت نسبي آنزيم ليپاز آزاد و تثبيت شده در دماهاي مختلف 79
4-10-پارامترهاي سينتيکي آنزيم ليپازسودوموناس آزاد و تثبيت شده روي نانو ذره کيتوسان 80
فصل پنجم: بحث و نتيجهگيري
بحث83
نتيجه گيري 87
مشکلات وپيشنهادات 89
منابع و مآخذ90
فهرست منابع فارسي91
فهرست منابع غير فارسي92
چکيده انگليسي100
فهرست جداول
عنوانصفحه
جدول 1-1- نمونههايي ازکاربردهاي صنعتي ليپاز 26
جدول 1-2- مزايا و معايب تثبيت آنزيم 31
جدول 1-3- کاربردهاي مختلف کيتوسان 37
جدول 3-1- محتويات معرف شماره يک در pH=8 66
جدول 3-2- محتويات معرف شماره دو در pH=466
جدول 3-3- روش کار اندازهگيري فعاليت ليپاز با استفاده از کيت پارس آزمون 67
جدول 4-1- اثر تغييرات pH بر فعاليت آنزيم ليپاز آزاد و تثبيت شده روي نانو کيتوسان در دماي °C4076
جدول 4-2- اثر تغييرات دما برفعاليت آنزيم ليپاز آزاد و تثبيت شده بر روي نانو ذره کيتوسان در pH، 5/7 78
جدول 4-3- مقادير پارامترهاي سينتيکي 80
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 3-1- منحني استاندارد جهت تعيين فعاليت ليپاز در طول موج 410 نانومتر به روش اسپکتروفتومتري 64
نمودار4-1- طيف مادون قرمز تبديل فوريه آنزيم ليپاز سودوموناس آزاد 73
نمودار4-2- طيف مادون قرمز تبديل فوريه آنزيم ليپاز سودوموناس تثبيت شده روي نانوذره کيتوسان 73
نمودار4-3- زتا سايزر نانو ذرات کيتوسان قبل از تثبيت آنزيم ليپاز 74
نمودار4-4-زتا سايزر ذرات کيتوسان ليپاز تثبيت شده با گلوتارآلدئيد75
نمودار4-5- اثر pHبر فعاليت آنزيم ليپاز آزاد و تثبيت شده برروي نانو ذره کيتوسان 76
نمودار4-6- مقايسه فعاليت نسبي آنزيم ليپاز آزاد و تثبيت شده در pH هاي مختلف 77
نمودار4-7- اثر دما بر فعاليت آنزيم ليپاز آزاد و تثبيت شده برروي نانو ذره کيتوسان 78
نمودار4-8- مقايسه درصد فعاليت نسبي ليپاز آزاد و تثبيت شده سودوموناس در دماهاي مختلف 79
نمودار4-10- منحني ميکائيليس- منتن براي آنزيم ليپاز سودوموناس آزاد 81
نمودار4-11- منحني ميکائيليس- منتن براي آنزيم ليپاز سودوموناس تثبيت شده بر روي نانو ذره کيتوسان 81
فهرست شکل ها
عنوانصفحه
شکل 1-1- نمونه اي از مسير واکنش براي واکنش کاتاليز شده 9
شکل 1-2- ساختار آنزيم 10
شکل 1-3- الگوي القايي مدل کوشلند- حالت دست دردستکش 15
شکل 1-4- اثر غلظت ماده اوليه بر سرعت واکنش آنزيمي17
شکل 1-5- صورت اجمالي اثر غلظت ماده اوليه بر مقدار کمپلکس آنزيم- ماده اوليه تشکيل شده 18
شکل 1-6- منحني فرضي واکنش آنزيمي 19
شکل 1-7- منحني اشباع آنزيمي 20
شکل 1-8- نمودار لينويور- برک 22
شکل 1-9- ساختار سه بعدي آنزيم ليپاز 23
شکل 1-10- طرح شماتيکي واکنش ليپوليز 28
شكل 1-11- رايج ترين روشهاي تثبيت 32
شکل 1-12- مقايسه ساختار شيميايي کيتين و سلولز 33
شکل 1-13- ساختار کيتين و کيتوسان 35
شکل 1-14- مقايسه ساختارشيميايي کيتين و کيتوسان و سلولز 38
شکل 3-1- فرمول شيميايي گلوتارآلدئيد52
شکل 3-2- فرم فضايي گلوتارآلدئيد52
شکل 3-3- سانتريفيوژ مورد استفاده در اين تحقيق54
شکل 3-4- سنيکيتور مورد استفاده در اين تحقيق55
شکل 3-5- اسپکتروفتومتر مورد استفاده در اين تحقيق55
شکل 3-6- استيرر مورد استفاده در اين تحقيق56
شکل 3-7- شيکرلوله مورد استفاده در اين تحقيق56
شکل 3-8-pH متر مورد استفاده در اين تحقيق57
شکل 3-9- ترازوي ديجيتال مورد استفاده در اين تحقيق57
شکل 3-10- حمام آبي مورد استفاده در اين تحقيق58
شکل 3-11- ميکروسکوپ الکتروني روبشي مورد استفاده در اين تحقيق60
شکل 3-12- دستگاه زتاسايزر مورد استفاده در اين تحقيق61
شکل 4-1- تصوير نانوذره کيتوسان با استفاده از ميکروسکوپ الکتروني روبشي (SEM) 72
چکيده:
ليپازها يکي از مهمترين آنزيمها در سيستمهاي بيولوژيکي در صنايع مختلف است. کاربرد ليپاز آزاد به دليل نيمه عمر کمتر در صنايع مقرون به صرفه نيست. تثبيت آنزيم روي پايههاي مختلف باعث افزايش پايداري، استفاده مکرر، سهولت جداسازي محصول، کنترل بيشتر واکنش و هزينه کمتر ميشود. تثبيت آنزيم غالبا بر روي پايه هاي متخلخل آلي يا معدني انجام ميشود اما در سالهاي اخير از انواع نانوذرات به دليل سطح تماس بالا در واحد حجم استفاده شد. هدف از اين مطالعه سنتز نانوذرات کيتوسان و تثبيت آنزيم ليپاز بطريق کووالان با واسطه گلوتارآلدئيد روي نانوذره و مقايسه فعاليت و پارامترهاي سينتيکي آنزيم آزاد و تثبيت شده ميباشد. ابتدا نانو ذره کيتوسان در آزمايشگاه سنتز و سپس عمليات تثبيت آنزيم بطريق کووالانسي از طريق واکنش بازشيف انجام شد. و با روشهاي ميکروسکوپ الکتروني روبشي (SEM)، طيف سنجي مادون قرمز (FT-IR) و زتا سايزر مورد بررسي و تأييد قرار گرفت. در مرحله بعد فعاليت آنزيم ليپاز آزاد و تثبيت شده به دو روش کيت تشخيصي پارس آزمون و روش استاندارد پارانيتروفنيل پالميتات (pNPP) اندازهگيري و پارامترهاي سينتيکي Km و Vm تعيين شدند. نتايج ميکروسکوپ الکتروني نشان داد که اندازه نانوذرات کيتوسان کمتر از nm100 است و بر اساس نتايج زتاسايزر اندازه ذرات قبل از تثبيت در محدوده nm300-10 و بعد از تثبيت آنزيم در محدوده nm500-20 بود. همچنين طيف FT-IR ليپاز آزاد و تثبيت شده بترتيب داراي پيک جذبي در طول موج cm-1 1645 و cm-1 9/1646 ميباشند که تثبيت ليپاز روي نانوذرات را تأييد نمود. pH بهينه ليپاز آزاد 7 و تثبيت شده، 5/7 بدست آمد. همچنين ليپاز آزاد در دماي °C30 وتثبيت شده در °C 40 بيشترين فعاليت را نشان داد. اگرچه ميزان پايداري و نيمه عمر کمتري در مقايسه با آنزيم تثبيت شده داشت.
براساس نتايج مطالعه حاضر ميتوان آنزيم ليپاز را بطور کووالان با واسطه گلوتارآلدئيد با موفقيت روي نانوذرات کيتوسان تثبيت نمود و آنزيم تثبيت شده داراي فعاليت و خصوصيات سينتيکي مناسبي براي کاربرد در صنايع مختلف است.
کلمات کليدي:نانوکيتوسان، ليپازسودوموناس، تثبيت، فعاليت آنزيم، خصوصيات سينتيکي
فصل اول
مقدمات و کليات
1-1-بيان مسئله:
ليپاز آنزيمي است که چربي را به اسيد چرب و الکل هيدروليز ميکند. ليپاز يک آنزيم همه کاره است که کاربرد هاي صنعتي بسياري دارد. اما پايداري ليپاز در محيط هاي مختلف نظير آنزيمهاي ديگر بيش از اندازه پايين ميباشد تا امکان استفاده آن را تحت شرايط سخت که براي کاربردهاي صنعتي لازم ميباشد، ميسرکند. به علاوه ليپاز گران قيمت است و به لحاظ اقتصادي استفاده از ليپاز به فرم آزاد مقرون به صرفه نيست و چون نيمه عمر آنزيم آزاد کمتر است و قابليت بکارگيري مکرر آن محدوديت دارد لذا از آنزيم تثبيت شده بر روي بسترهاي مختلف استفاده ميکنند. به دليل قابليت حل بالاي آن در آب نميتوان از آن مجددا استفاده کرد. بسياري از تحقيقات استفاده از تکنيک هاي تثبيت را براي غلبه بر اين محدوديت ها مورد بررسي قرار دادند.
براي تثبيت آنزيم ليپاز غالبا از پايه هاي متخلخل آلي استفاده ميشد اما در سال هاي اخير از انواع نانو ذرات به دليل سطح تماس بالا و حجم بالاي منافذ که ورود مولکولهاي آنزيم را تسهيل ميکند استفاده شده است چون فعاليت و قابليت بکارگيري مکرر و پايداري عملياتي آن را افزايش ميدهد.
يکي از انواع مناسب حامل هاي نانو، ذرات کيتوسان ميباشد که يک نوع پليمر بيولوژيکي است لذا در اين تحقيق خصوصيات سينتيکي آنزيم ليپاز آزاد و تثبيت شده برروي نانو ذره کيتوسان بررسي خواهد شد.
1-2-اهداف تحقيق :
اين تحقيق در نظر دارد با بکارگيري کيتوسان و تثبيت آنزيم ليپاز قابليت امکان استفاده مکرر ازاين آنزيم را به وجود آورد لذا مهمترين اهداف تحقيق عبارتند از:
1-مشخص کردن ميزان فعاليت آنزيم ليپاز تثبيت شده در مقايسه با آنزيم ليپاز آزاد.
2-استفاده از نانو ذره کيتوسان بعنوان بستر مناسب براي تثبيت آنزيم ليپاز بجاي تثبيت آن بر روي پايه هاي متخلخل آلي که بازده کمتري در مقايسه با حامل هاي نانو دارند.
3-استفاده مکرر و موثرتر آنزيم ليپاز و نيز کاهش هزينه هاي انجام فرآيند.
1-3- فرضيه هاي تحقيق:
با توجه به اهداف متصور براي تحقيق حاضر و دستيابي به پاسخ هاي مناسب براي سوالات مطرح شده فرضيات زير مورد توجه قرارخواهد گرفت:
1-استفاده از آنزيم ليپاز تثبيت شده بر روي نانوذره کيتوسان خصوصيات سينيتيکي مناسب تري نسبت به آنزيم آزاد دارد.
2-نانو کيتوسان بعنوان يکي از بهترين حامل هاي آلي براي تثبيت آنزيم به شمار مي رود.
1-4- مفهوم نانوتکنولوژي1:
نانوتكنولوژي مطالعه ذرات در مقياس اتمي براي كنترل آنهاست. هدف اصلي اكثر تحقيقات نانوتكنولوژي شكل‌دهي تركيبات جديد يا ايجاد تغييراتي در مواد موجود است. نانوتكنولوژي در الكترونيك، زيست‌شناسي، ژنتيك، هوانوردي و حتي در مطالعات انرژي بكار برده مي شود. نانوتکنولوژي به توليد مواد، قطعات و سيستم هاي مفيد با کنترل آنها در مقياس طولي نانومتر و بهره برداري از خصوصيات و پديده هاي جديد حاصله در آن مقياس گفته مي شود [6]. به عبارت ديگر نانو فناوري به تکنولوژي گفته مي شود که کليه فعاليت ها جهت ايجاد ساختاري ظريف در مقياس نانو براي تغيير در تک تک اتمها و مولکولها را شامل ميشود، به طوري که مواد و وسايل جديد با خواص مورد نظر و مطلوب قابل ساختن ميشوند [7]. بدين ترتيب ترکيباتي توليد ميشوند که انتظار ميرود در بازارهاي آينده نقش کليدي بازي کنند. تفاوت اصلي فناوري نانو با فناوري هاي ديگر در مقياس مواد و ساختارهايي است که در اين فناوري مورد استفاده قرار ميگيرند. البته تنها کوچک بودن اندازه مد نظر نيست، بلکه زماني که اندازه مواد در اين مقياس قرارميگيرد، خصوصيات ذاتي آنها از جمله رنگ، استحکام و … نيز تغيير مييابد[8].
1-4-1-کاربردهاي نانو تکنولوژي:
امروزه فناوري نانو به طور شگفت آوري در تمامي علوم وارد شده و نقش تعيين کننده اي در مراحل مختلف توليد ايفا ميکند که در زيربه طور مختصر به برخي کاربردهاي آن اشاره ميشود:
1-4-1-1- توليد مواد و محصولات صنعتي: نانو تکنولوژي تغيير بنياني مسيري است که در آينده، موجب ساخت مواد و ابزارها خواهد شد. امکان سنتز بلوک هاي ساختماني نانو با اندازه و ترکيب به دقت کنترل شده و سپس چيدن آنها در ساختار بزرگتر، که داراي خواص منحصر به فرد باشند، انقلابي در مواد و فرآيندهاي توليد آنها، ايجاد ميکند. از مزاياي نانوساختارها ميتوان به سبکتر، قويتر و قابل برنامهريزي بودن آنها، کاهش هزينه عمر کاري آنها از طريق کاهش دفعات نقص فني، ابزارهايي نوين بر پايه اصول و معماري جديد اشاره کرد ]9[.
1-4-1-2- پزشكي و بدن انسان: رفتار مولكولي در مقياس نانومتر، سيستم هاي زنده را اداره ميكند. يعني مقياسي که شيمي، فيزيک، زيستشناسي و شبيه سازي کامپيوتري، همگي به آن سمت در حال گرايش هستند ]10[.
فراتر از سهولت استفاده بهينه از دارو، نانوتکنولوژي ميتواند فرمولاسيون و مسيرهايي براي رهايش دارو، تهيه کند، که توان درماني داروها را افزايش دهد ]11[.
1-4-1-3- پايداري منابع: ميتوان به منابعي همچون كشاورزي، آب، انرژي، مواد و محيط زيست پاك اشاره کرد. گستردگي تعاملات بين اين فناوري و علوم جانبي آنها، از ويژگيهاي کاملا بارز اين فناوري جديد است. تقسيمبندي فناوري نانو در شاخهها و رشتههاي مختلف بيشتر مربوط به کاربرد محصولات اين فناوري در هر رشته ميباشد. در ضمينه مسائل زيست محيطي، غذايي، دارويي نيز استفاده از نانو اجتناب ناپذير خواهد بود.
1-4-1-4- صنايع غذايي: حوزههاي مختلف كاربردي فناوري نانو در غذا و صنايع غذايي را مي توان به پنج دسته زير تقسيم بندي نمود:
الف- بهبود طعم و رنگ: به کمک فناوري نانو توانسته اند در مواد غذايي مختلف خواصي ايجاد کنند که ايجاد احساس طعم و بوي خاص در مصرف کننده ميکند. مثلا توليد سس کم چربي که مزه چربي ميدهد در حالي که چربي ندارد.
ب- سلامت غذايي: براي اطمينان از سلامت غذايي، پژوهشگران در پروژهاي از نانو حسگرهاي قابل حمل براي يافتن مواد شيميايي مضر، پاتوژنها وسمها در مواد غذايي استفاده کردهاند، با اين کار نيازي به فرستادن نمونههاي مواد غذايي به آزمايشگاه، براي تشخيص سلامت و کيفيت محصولها در کشتزارها و کشتارگاهها نيست. همچنين اين پروژه، در حال توسعه بهکارگيري زيست تراشههاي DNA براي کشف پاتوژن هاست. اين روش ميتواند در تشخيص باکتري هاي مضر و متفاوت در گوشت يا ماهي ويا قارچ هاي ميوه مؤثر باشد.
ج-بستهبندي: بستهبندي در واقع اولين ارتباط مشتري با محصول است.بيشترين کاربردي که نانو در صنعت دارد مربوط به بستهبندي است چراکه:
1: بستهبندي، محصول را از صدمات فيزيکي و آلودگيها حفظ ميکند.
2:کيفيت ضدميکروبي و خواص ممانعتي آن، بهداشت بهتر، کنترل بيشتر، ممانعت از بيرنگي و خسارت کمتر به ساختار آن را باعث ميشود.
3: استحکام در برابر حرارت. يعني از فساد و پلاسيدگي ميوهها و سبزيها در دماي بالا جلوگيري ميکند.
4: زمان ماندگاري محصولات در بستهبنديهاي نانو از سه يا چهار روز به دو تا سه هفته در شرايط دماي محيط بيرون از يخچال افزايش مييابد.
د- توليد غذا: در بخش توليد ميتوان در صنعت کشاورزي و همچنين در ابداع روشهاي جديد براي توليد غذا از اين فناوري بهره گرفت مانند: آنتي بيوتيکها، ژنهاي گوناگون گياهان، توليد آفتکشهاي بي خطر و کاهش اثرات منفي آفتکشهاي موجود.
و- نگهداري غذا:
1- ضدعفوني و ضد ميکروب نمودن سطوح: نانو ميتواند با جابهجا کردن سطح پوشش مواد، از ورود هرگونه ريزساختههاي زنده يا ميکروب به غذا جلوگيري کرده و سبب ضدعفوني شدن سطوح غذاها شود.
2- حفاظت آنتي اکسيدانها: با استفاده از نانو حفرهها ميتوان از خراب شدن مواد بيثباتي مثل آنتي اکسيدانهاي حساس از جمله ويتامينهاي E ،D،A و امگا3 جلوگيري به عمل آورد.
3- دستکاري و کنترل فعاليت آنزيمها: نانو حفرهها ميتواند در شناسايي و طراحي ساختمان آنزيمها و کنترل سوخت و ساز آنها با تغيير در ساختار و افزودن ذرات فعال به مواد غذايي استفاده شود.
1-5- آنزيم ها:
زندگي به يک سري واکنشهاي شيميايي وابسته است که بسياري از اين واکنشها بسيار کند انجام گرفته و به خودي خود قادر به حفظ حيات نميباشند. اين واکنشها با کاتاليستهايي به نام آنزيم تسريع ميشوند. توان کاتاليزوري آنزيمها، انجام فرآيند لازم براي حيات در تمام موجودات از ميکرواورگانيسمها تا انسانها تسهيل ميکنند. بسياري از آنزيمها پتانسيل کاتاليزوري خود را پس از استخراج از ارگانيسم زنده حفظ ميکنند و قابل استفاده در فرآيندهاي صنعتي ميباشند]12[.
1-5-1- خصوصيات آنزيمها:
آنزيمها داراي ساختار پروتئيني ميباشند و به عنوان كاتاليزورهاي بيولوژيكي براي انجام واكنشهاي شيميايي در مقايسه با كاتاليزورهاي غير بيوشيميايي مزايائي مثل: ويژه بودن محصول وسوبسترا فعاليت تحت شرايط ملايم واكنش، خارج كردن آسان محصول، ‌كاهش استفاده از مواد شيميايي سمي، توليد سريع كاتاليزور از منابع قابل تجديد، انرژي اكتيواسيون مطلوب و بازدهي كاتاليزوري مناسب دارند.
آنزيمها ترکيباتي هستند که ميتوانند سرعت واکنش را تا حدود 107 برابر افزايش دهند. آنزيم مانند يک کاتاليزگر غيرآلي واکنش را با پايين آوردن انرژي فعال سازي2 لازم براي انجام واکنش تسريع ميکند و بر خلاف آن انرژي فعال سازي را با جايگزين کردن يک سطح انرژي فعال سازي کوچک پايين ميآورد]13[ شکل 1-1.
انجام سريع يک واکنش در موقعيت آزمايشگاهي به شرايط ويژهاي مانند دما و فشار بالا نياز دارد. لذا بايد در ياخته که شرايط محيطي در آن کاملا ثابت است و انجام چنين واکنشهايي بسيار کند است، اين عمل بوسيله آنزيمها صورت گيرد.
کاتاليزورها در واکنشها بدون تغيير ميمانند، ولي آنزيمها مانند ساير پروتئينها تحت شرايط مختلف پايدار نميمانند. اين مواد در اثر حرارت بالا و اسيدها و قلياها تغيير ميکنند تا به تعادل برسند. آنزيمها با کاهش انرژي فعالسازي سرعت واکنش شيميايي را افزايش ميدهند ]15 و14[.
شکل 1-1- نمونه اي از مسير واکنش براي واکنش کاتاليز شده
آنزيمها مولکولهاي پروتئيني هستند که داراي يک يا چند محل نفوذ سطحي ( جايگاههاي فعال) هستند که سوبسترا يعني مادهاي که آنزيم بر آن اثر ميکند، به اين نواحي متصل ميشود. تحت تأثير آنزيمها، سوبسترا تغيير ميکند و به يک يا تعدادي محصول تبديل ميشود. از ديدگاه صنعتي، توليد، تغليظ، استخراج و خالص سازي آنزيمها از محيطهاي کشت حاوي Aspergillus،Penecillium ،Mucor، وRhizopus امکانپذير بوده و توليد آنها داراي توجيه اقتصادي است ]16 [. آنزيمها ماهيتي پروتئيني دارند و ساختار بعضي ساده يعني از يک زنجيره پليپپتيدي ساخته شدهاند و بعضي اليگومر هستند. ساختار بعضي از آنزيمها منحصرا از واحد هاي اسيد آمينه تشکيل يافته اما برخي ديگر براي فعاليت خود نياز به ترکيبات غيرپروتئيني دارند که به نام گروه پروستتيک3 معروف است و اين گروه ميتواند يک فلز يا يک کوآنزيم4 باشد و با آنزيم اتصال محکمي را برقرار ميکنند. بخش پروتئيني آنزيم (بدون گروه پروستتيک) آپوآنزيم5 نام دارد و مجموع آنزيم فعال از نظر کاتاليزوري و کوفاکتور مربوطه هولوآنزيم6 نام دارد.
از ويژگيهاي مهم آنزيمها اين است که پس از انجام هر واکنش و در پايان آن سالم و دست نخورده باقي ميمانند و ميتوانند واکنش بعدي را کاتاليز کنند. در يک واکنش ساده آنزيمي، ابتدا آنزيم (E) با ماده اوليه يا سوبسترا7 (S) ترکيب ميشود و کمپلکس آنزيم-سوبسترا ميدهد در مرحله بعدي با انجام واکنش، فراورده يا محصول (P) ايجاد ميشود و آنزيم رها ميگردد ]17-19[.
شکل 1-2- ساختار آنزيم
در زير نمونه اي از واکنشهاي ساده آنزيمي نشان داده شده است:
E + S ? ES
ES ? E + P
1-1-واکنش آنزيمي
1-5-2- خصوصيات واکنشهاي آنزيمي:
آنزيمها کاتاليزورهاي زيست شناختي اي هستند که طبيعتا از مولکوهاي پروتئين، توسط سلولهاي زنده (حيواني، گياهي و ميکروارگانيسمها) توليد ميشوند. آنزيمها در واکنشهاي زيست شناختي نقش بسيار عمده اي بر عهده دارند و در اغلب واکنشهاي درون سلولي باعث شکستن پيوندهاي شيميايي ترکيبات ميشوند، بنابراين، ويژگي عمده اين مواد، افزايش سرعت واکنشهاست بدون اينکه خود در واکنش شرکت داشته باشند.
قابليت کاتاليزگري آنزيم ها به خاطر وجود مولکولهاي پروتئين با ساختمانهاي ويژه در آنهاست و واکنشهاي شيميايي در موضع مخصوصي بهنام موضع فعال آنزيم انجام ميپذيرند. و اصولا پاره اي از برهم کنشهاي فيزيکي و شيميايي در اين موضع باعث انجام اين واکنشها براي يک آنزيم ويژه ميشود.
تفاوت عمده واکنشهاي آنزيمي با واکنش هاي شيميايي در موارد زير خلاصه ميشود:
1-يک آنزيم کاتاليزگر داراي ويژگي خاصي است که فقط قادر است يک يا تعداد کمي از واکنشها را کاتاليز کند.
2-سرعت انجام واکنشهاي شيميايي با حضور آنزيم به مراتب بالاتر از حالت بدون آنزيم است و معمولا با بکارگيري مقادير بسيار کمي آنزيم، واکنشها کاتاليز ميشوند.
3-شرايط فيزيکي نظير دما، فشار و pHمحيط در واکنشهاي آنزيمي معمولا در حد متعادل بوده و از فشار و دماهاي بالا کمتر استفاده ميشود.
4-آنزيمها در مقابل تغيرات ناگهاني شرايط، حساس و ناپايدارند و کار کردن با آنها مستلزم دقت و توجه خاص است ]1 [.
با توجه به اينکه ساختمان شيميايي آنزيمها از پروتئين با آمينو اسيدهاي ويژه اي شکل گرفته است توليد انبوه آنها از طريق سنتز شيميايي بسيار مشکل و در بعضي حالات غير عملي است. آنزيمها معمولا از لحاظ ميکرواورگانيسمهاي رشد يافته در محيطهاي خالص و مخصوص، يا به طور کلي آنزيمهاي تجارتي، به سه گروه اصلي طبقه بندي ميشوند:
1-آنزيمهاي صنعتي که در صنايع مختلف از جمله صنايع غذايي به کار گرفته ميشوند، مانند: آميلاز، پروتئاز، کاتالاز و پنيسيلين آسيلاز.
2-آنزيمهاي تجزيه اي که در تجزيه مواد از آنها استفاده ميشود. نظير گلوکز اکسيداز، گالاکتوز اکسيداز، الکل دهيدروژناز ، هگزوکيناز، موراميداز، کلسترول اکسيداز.
3-آنزيمهاي پزشکي که در مسائل پزشکي مورد توجه اند مثل آسپاراژيناز، پروتئاز، ليپاز، و استرپتوکيناز.
کاربرد آنزيمها در صنايع، روز به روز گسترش مييابد و دليل عمده ي آن، توليد محصولي است با درجه ي خلوص و کيفيت بالاتر، به طور کلي مزاياي کاتاليزگر آنزيمي به مراتب بيشتر از کاتاليزگرهاي غيرآنزيمي است زيرا با استفاده از کاتاليزگر اختصاصي آنزيمي ميتوان از واکنشهاي ناخواستهي جانبي که در طي مصرف کاتاليزگرهاي غير اختصاصي انجام ميشوند اجتناب کرد ]2[.
قدرت آنزيمها در بهکارگيري اثرشان در دماهاي نسبتا پايين کمک بيشتري به پيشگيري از واکنشهاي جانبي ناخواسته ميکند. بهدليل آنکه آنزيمها را معمولا با غلظتهاي خيلي کم مصرف ميکنند، جداسازي آنها پس از تکميل واکنش معمولا غيرضروري و يا آسانتر از حالتي است که کاتاليزگر استفاده شود و پيشرفتهاي اخير در زمينه تهيه و استفاده از آنزيمهاي تثبيت شده که با مواد نامحلول واسطهي واکنش ايجاد پيوند ميکنند ويا جذب آنها ميشوند، باعث افزايش امتيازات سيستمهاي کاتاليزگر آنزيمي شده است. اين آنزيمها حتي در مواردي که آنزيم واقعا به صورت محلول نيست مؤثر عمل ميکند در نتيجه مشکل جداسازي آنزيم از ماد? اوليه در انتهاي واکنش به حداقل ميرسد، زيرا فاز جامد و آنزيم ملحق شده به آن را ميتوان به راحتي به روش صاف کردن جدا کرد. سپس آنزيم براي انجام واکنش هاي بعدي قابل استفاده است. در بسياري از موارد، استفاده از آنزيم تثبيت شده در يک سيستم پيوسته امکان پذير است. به عنوان مثال، محلولي از مواد واکنش آنزيمي به طور پيوسته از بستري از آنزيم عبور کرده واکنش مورد نظر به هنگام عبور جريان مايع انجام ميشود. ميزان انجام واکنش را ميتوان با تنظيم سرعت عبور محلول از بستر ثابت آنزيم کنترل کرد.
معمولا استفاده از آنزيم با غلظت زياد برروي مواد جامد، که بتواند مدت زمان لازم براي انجام واکنش در محلول را طي عبور از واکنشگاههاي بسيار کوتاه کند، امکانپذير است. بنابراين ميتوان ميزان انجام واکنش در زيست واکنشگاههاي کوچک را نيز افزايش داد. به اين ترتيب، مدت قرار گرفتن ماد? اوليه تحت شرايط دما و pH لازم براي انجام واکنش، کم ميشود، در نتيجه واکنشهاي جانبي که احتمالا طي واکنش دراز مدت اتفاق ميافتد به ميزان زيادي کاهش مييابد و درج? خلوص محصولات واکنش زيادتر خواهد شد. امکان استفاده از آنزيم با غلظت زياد در حالت تثبيت شده، باعث انجام واکنش به طور پيوسته و در دماي نسبتا کم و همچنين استفاده از زيست واکنشگاههايي با ابعاد مناسب ميشود. به اين ترتيب، مدت فعاليت آنزيم بيشتر شده در نتيجه هزينهي کلي به ازاي وزن واحد محصول کاهش مييابد ]1 [.
به طور کلي ويژگيهاي کاتاليزگري يک آنزيم را ساختمان شيميايي و ترکيب آن تعيين ميکند. ميزان انجام واکنش نوري و درج? نهايي آن بستگي به عوامل متعددي از قبيل غلظت ماد? اوليه و آنزيم، دما، pH، قدرت يوني، فعالسازها، بازدارندههاي خاص و مدت انجام واکنش دارد. عوامل مشابهي نيز برميزان انجام واکنش بدون فعاليت کاتاليزي اثر ميگذارند. گرچه اثر کاتاليزگرهاي آنزيمي به طور کلي اختصاصي است، اما يک آنزيم ميتواند واکنشهايي را که شامل ترکيبات کاملا مختلف هستند کاتاليز کند. در چنين مواردي پيوندهاي بين اتمي و گروههاي همسايه مشابه هستند. در کاربردهاي صنعتي آنزيم، ميتوان از کلي? عاملهاي موثربر خواص کاتاليزي آنزيم براي کنترل استفاده کرد. در بيشتر موارد شرايطي مورد استفاده قرار ميگيرد که تحت تاثير آنها اقتصادي ترين موازنه بين عامل هاي موثر بر ميزان واکنش اصلي مورد نظر و واکنشهاي جانبي ناخواسته و ميزان کاهش فعاليت آنزيمي ايجاد گردد. بنابراين شرايط بهينه در استفاده صنعتي از يک آنزيم، ممکن است با شرايط موصوف نظري درباره آنزيم بسيار متفاوت باشد. طبيعتا هزينه مناسب و افزايش ارزش محصول توليدي در تعيين شرايط بهين? صنعتي، در درجه اول اهميت قرار دارند ]2[.
1-5-3- پارامترهاي موثر بر واکنش هاي آنزيمي:
پارامترهاي محيطي متعددي بر توان کاتاليزوري آنزيم تأثير ميگذارند. اين فاکتورها نه تنها بر فعاليت آنزيم، بلکه بر پايداري آن نيز اثر ميگذارند. در اين بخش به برخي از اين پارامترها اشاره ميشود.
1-5-3-1- دما :
از مهمترين پارامترهاي موثر درسيستم هاي بيولوژيکي ميباشد. در فرآيندهاي آنزيمي، دما، اثرات معکوس بر فعاليت و پايداري آنزيم اعمال ميکند. افزايش دما سرعت واکنش شيميايي را افزايش مي دهد و در عين حال باعث ميشود آنزيم با سرعت بيشتري فعاليت خود را از دست دهد. معمولا در دماهاي پايين تر از 30 درجه سانتيگراد و براي دوره زماني کم، از دست رفتن فعاليت آنزيم ناچيز بوده و با افزايش دما سرعت واکنش افزايش مييابد. در دماهاي بالاتر، فعاليت آنزيم با پيشرفت واکنش، سرعت بيشتري کاهش مييابد. بنابر اين مقدار بهينه دما با افزايش زمان واکنش کاهش مييابد]20[.
1-5-3-2-pH:
عملکرد آنزيم به شدت تحت تاثير pHقرار ميگيرد. کاهش فعاليت آنزيم در محدوده اي از pH ميتواند در نتيجه دو عامل اصلي باشد. اول، pHبر پايداري آنزيم اثر ميگذارد و ميتواند آن را به طور برگشت ناپذيري غيرفعال کند. دوم تغيير pH ميتواند پارامترهاي سينتيکي واکنش آنزيمي را تغيير دهد. به اين صورت که ممکن است بر پايداري حالت واسطه و يا بر مرحله کنترل کننده سرعت واکنش تأثير بگذارد ]21[.
1-5-3-3-بازدارندهها8:
بسياري از ترکيبات طبيعي و شيميايي در واکنش هاي آنزيمي نقش بازدارنده دارند. بازدارندهها ترکيباتي شيميايي هستند که با اضافه شدن به مخلوط واکنش سرعت واکنش هاي آنزيمي را کاهش ميدهند. بازدارنده ها به دو دسته کلي بازدارنده هاي برگشت پذير و برگشت ناپذير تقسيم ميشوند. بازدارنده هاي برگشت ناپذير، با برقراري پيوندهاي غيرکووالانسي 9با آنزيم، کاملا آن را غير فعال ميکنند. آنزيم غير فعال شده با اين نوع بازدارنده ها را نميتوان با دياليز10 يا روش هاي ساده فعال کرد. بازدارنده هاي برگشت پذير پيوندهاي کووالانسي با آنزيم برقرار کرده و فعاليت آنزيم را کاهش ميدهند. اين نوع بازدارنده ها با دياليز حذف شده و مجددا فعاليت کاتاليزوري آنزيم به طور کامل قابل دستيابي است ]22[.
هر آنزيم بر سوبستراي ويژه خود اثر کرده و فرآورده ويژهاي را توليد ميکند. به اين منظور هر آنزيم ساختار سه بعدي ويژه خود را دارا است. که آن را براي انجام فعاليت کاتاليستي مناسب ميسازد و بخشي از آنزيم که با سوبسترا بند و بست مييابد، جايگاه فعال نام دارد ودر مورد اتصال آنزيم به سوبسترا الگوهايي ارائه شدهاند که مدل کوشلند11 که الگوي القايي نام دارد و حالت دست در دستکش را دارد، نشان ميدهد. بطوري که محل اتصال حالت انعطافپذيري دارد ]23-25 [.
شکل 1-3- الگوي القايي مدل کوشلند- حالت دست دردستکش
1-5-4- سينتيک واکنش آنزيمي:
اصول کلي سينتيک واکنشهاي آنزيمي مشابه سينتيک واکنشهاي شيميايي است با اين تفاوت که در آنزيمها پديده سيرشدگي آنزيم توسط ماده اوليه مشاهده ميشود، در حالي که اين پديده در واکنشهاي غيرآنزيمي ديده نشده است. پديده سيرشدگي آنزيم توسط ماده اوليه در تمام آنزيمها صادق است. يعني جهت دستيابي به سرعت بيشينة واکنش، بايد آنزيم به حالت سير شده از ماده اوليه موجود باشد. سرعت واکنش آنزيمي تحت تأثير بسياري عوامل فيزيکي و شيميايي واقع مي شود که به ترتيب مدنظر قرار ميگيرند.
براي اولين بار مدل رياضي سينتيک واکنش آنزيمي در سال 1902 ميلادي توسط هنري12 ارائه شد و در سال 1913 ميكائليس13 و منتن14 يك نظريه كلي راجع به سينتيك آنزيمي بيان كردند، اکثر واکنشهاي آنزيمي ساده با سينتيک ميکائيلس- منتن يا سينتيک اشباع بررسي ميشوند. يک محلول آنزيمي تعداد ثابتي موضع فعال جهت پيوند با سوبسترا دارد. در غلظتهاي بالا از سوبسترا، تمام اين مواضع فعال توسط سوبسترا اشغال شده و در واقع آنزيم اشباع ميگردد. سينتيک اشباع از يک طرح ساده واکنش به دست ميآيد که شامل يک مرحله برگشت پذير جهت تشکيل حالت واسطه و يک مرحله برگشت ناپذير جهت تجزيه حالت واسطه ميباشد]26 [.
1-2- واکنش ساده آنزيمي مدل ميکائيليس- منتن
1-5-5-عوامل موثر برسرعت و فعاليت آنزيمها:
سرعت واکنش آنزيمي تحت تأثير عواملي مانند غلظت مادة اوليه، غلظت آنزيم، pH، دما، وجود فعالساز و مهارکننده، ثابت دي الکتريک و قدرت يوني حلال واقع مي شود. جهت تعيين اثر هر يک از عوامل ذکر شده بر روي خصوصيت آنزيم لازم است بقيه عوامل ثابت نگهداشته شوند.
1-5-5-1-اثر غلظت ماده اوليه برسرعت واکنش آنزيمي:
جهت بررسي اثر غلظت ماده اوليه برسرعت واکنش آنزيمي، لازم است کليه پارامترها از جمله غلظت آنزيم را ثابت نگهداشته و تنها غلظت مادة اوليه تغيير کند.
سرعت واکنش آنزيمي برحسب غلظت مادة اوليه طبق شکل زيرتغيير ميکند.
شکل 1-4- اثر غلظت ماده اوليه بر سرعت واکنش آنزيمي
طبق فرضيات هانري و براون در سال 1902، اگر غلظت ماده اوليه پايين باشد، تمام مولکولهاي آنزيم با مادة اوليه ترکيب نميشود. در حالت غلظت بالاي مادة اوليه، مقدار بيشتري از آنزيم با مادة اوليه ترکيب ميشود و بالاخره در غلظت بالاتر تمام آنزيم با مادة اوليه ترکيب ميشود .
شکل 1-5- صورت اجمالي اثر غلظت ماده اوليه بر مقدار کمپلکس آنزيم- ماده اوليه تشکيل شده
در صورتي که تمام آنزيم با مادة اوليه ترکيب شود و آنزيم توسط مادة اوليه به حالت سيرشده درآيد، افزايش بيشتر غلظت مادة اوليه، منجر به افزايش سرعت واکنش نمي شود و سرعت واکنش در اين حالت سرعت پيشينه ناميده مي شود.
1-5-6- معادله ميکائيليس- منتن:
اولين مدل رياضي در مورد سرعت واکنش آنزيمي توسط ميکائيليس و منتن در 1913 براساس نظريه هانري و براون ارائه شد . طبق نظريه ميکائيليس و منتن در روابط زير، E، آنزيم يا S، مادة اوليه و ES مجموعه آنزيم ـ مادة اوليه هستند. در شکل زير منحني فرضي واکنش آنزيمي ديده مي شود.
شکل 1-6- منحني فرضي واکنش آنزيمي ـ در حالت (الف) و (ب) واکنش برگشت ناپذير است.
در حالت (الف)، غلظت آنزيم و ماده اوليه با هم برابرند. در حالت (ب)، غلظت ماده اوليه بيشتر از غلظت آنزيم است.
همانطور که در واکنش 1-2 مشخص است، سرعت توليد محصول به صورت زير است:
1-3
سرعت کلي توليد حالت واسطه تفاضل سرعت واکنشهاي توليد و مصرف اين ماده ميباشد:
1-4
ثابت ميماند :
1-5
غلظت کل آنزيم برابر مجموع غلظتهاي آنزيم آزاد و آنزيم متصل به سوبسترا ميباشد:
1-6
با ترکيب روابط (1-4) و (1-6) عبارت زير به دست ميآيد:
1-7
ثابت ميکائيليس (KM) ، به صورت زير تعريف ميشود:
1-8
در منحني اشباع آنزيمي، Vm از نقاط سرعت هاي بهدست آمده در غلظت هاي بالاي سوبسترا حاصل ميشود. اين نقاط در امتداد يک خط افقي قرار گرفته اند که محور V را در محل V=Vm قطع ميکند.حال اگر نصف مقدار فوق يا 1/2Vm روي محور مشخص شده و از آن خطي به موازات محور V رسم گردد، محل تقاطع خط با منحني معرف مقدار سوبسترايي است که مقدار عددي آن مساوي Km ميباشد. به عبارتي ميتوان گفت Km معادل مقدار سوبسترايي است که نصف سرعت ماکزيمم را ايجاد نمايد. اين ارتباط از طريق معادله ميکائيليس- منتن نيز حاصل ميشود. زيرا چنانچه به جاي S در معادله، Km جايگزين شود مقدار V=1/2Vm به دست ميآيد.
شکل 1-7- منحني اشباع آنزيمي
با ترکيب روابط (1-7) و (1-8) عبارت زير به دست ميآيد:
1-9
با حل معادله (1-9) براي حالت واسطه، نتيجه ميشود:
1-10



قیمت: تومان


پاسخ دهید