دانشکده صنايع غذايي
پاياننامه جهت اخذ درجه کارشناسي‌ارشد در رشته
علوم و صنايع غذايي
بررسي ميزان بقاء لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 ريزپوشاني شده توسط صمغ فارسي (زدو) در ماست و در شرايط شبيه‌سازي شده گوارشي
پژوهش و نگارش:
الهام خيرخواه
اساتيد راهنما:
دکتر مرتضي خميري
دکتر صبيحه سليمانيانزاد
استاد مشاور:
دکتر سيد مهدي جعفري
زمستان 1392
تعهدنامه پژوهشي
نظر به اينکه چاپ و انتشار پايان نامه‌هاي تحصيلي دانشجويان دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبيعي گرگان مبين بخشي از فعاليت‌هاي علمي- پژوهشي بوده و همچنين با استفاده از اعتبارات دانشگاه انجام مي‌شود؛ بنابراين به منظور آگاهي و رعايت حقوق دانشگاه دانش آموختگان اين دانشگاه نسبت به رعايت موارد ذيل متعهد مي‌شوند:
1- قبل از چاپ پايان ‌نامه خود، مراتب را قبلا به طور کتبي به مديريت تحصيلات تکميلي دانشگاه اطلاع داده و کسب اجازه نمايند.
2- قبل از چاپ پايان نامه در قالب مقاله، همايش، اختراع و اکتشاف و ساير موارد، ذکر نام دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبيعي گرگان الزامي است.
3- انتشار نتايج پايان نامه بايد با اطلاع و کسب اجازه از استاد راهنما صورت گيرد.
اينجانب الهام خيرخواه دانشجوي رشته علوم و صنايع غذايي مقطع کارشناسي‌ارشد تعهدات فوق و ضمانت اجرايي آن را قبول کرده و به آن ملتزم مي‌شوم.
نام و نام خانوادگي و امضاء
تقديم به پدر و مادر مهربان و صبورم،
تا زندهام مديون زحماتشان هستم، آنان که در طول سالهاي زندگيام عاشقانه‌ترين لحظههاي عالم را برايم رغم زدند. آنان که اگر دلگرمي صداقتشان نبود، هرگز شکوه لحظه باليدن به باور رفتن و رسيدن مهيا نمي‌شد.
و تقديم به همسر عزيزم،
که وجودش همواره مايه آرامش و نگاه گرمش پشتيبان لحظه لحظه زندگيام بوده است…
تشکر و قدرداني
سپاس خداوندي را که اگر لطف بيکرانش نبود، تلاش و پويش بيمعنا ميشد. او که در تمام لحظههاي سخت و سهل بود و چگونه بودن را به من آموخت. از پدر و مادر عزيزم که بستري مناسب براي رشد و شکوفايي فرزندانشان فراهم آرودند، آنان که در کمال سعهي صدر و با حسن خلق و فروتني مرا همراهي کردند، کمال تشکر و قدرداني را دارم.
از اساتيد راهنماي گرانقدرم جناب آقاي دکتر مرتضي خميري و استاد بزرگوارم سرکار خانم صبيحه سليمانيانزاد که راهنماييهاي ارزشمندشان در تمام مراحل اين پژوهش روشنيبخش مسير تحقيق بودند، آنان که به من آموختند چگونه در سايه صبر و کوشش بياموزم، آنگونه که بايد آموخت و چگونه دشواريها را به پشتوانه علم آموزي پشت سر بگذارم، بي نهايت سپاسگزارم.
از استاد مشاور بزرگوارم جناب آقاي دکتر سيد مهدي جعفري به خاطر راهنماييهاي بي دريغشان کمال تشکر را دارم. از استاد گرانقدر جناب آقاي يحيي مقصودلو به پاس قبول زحمت داوري اين رساله و ارائه نقطه نظرات ارزشمندشان سپاسگزارم. از ساير اساتيد بزرگوار گروه علوم و صنايع غذايي دانشگاه صنعتي اصفهان، به ويژه سرکار خانم سليمانيانزاد که افتخار شاگردي ايشان را نيز داشتهام، و جناب آقاي شيخ زينالدين، بي نهايت سپاسگذارم.
از همسر عزيزم جناب آقاي مهندس فرزاد خورسندي به پاس همراهي و حمايتهاي ايشان در انجام اين تحقيق و برادر و خواهر عزيزم خانم دکتر الهه خيرخواه به پاس زحمات و حمايتهايشان کمال تشکر و قدرداني را دارم.
از عزيزان پرتلاش گروه علوم و صنايع غذايي دانشگاه صنعتي اصفهان خصوصا خانم مهندس ستاري و آقاي کريمي به خاطر مساعدتهاي صميمانهشان سپاسگزارم. از تمامي دوستان و همکلاسيهاي عزيزم خصوصا خانمها عاطفه رمضاني، مريم فضلي و سميرا مختاري و خانم مهندس بخشي کمال تشکر را دارم.
آزمايشهاي عملي پژوهش حاضر در آزمايشگاه ميکروبيولوژي گروه علوم و صنايع غذايي دانشگاه صنعتي اصفهان انجام شد که بدين وسيله از مسئولين و دست‌اندرکاران اين آزمايشگاه سپاسگزاري ويژه به عمل ميآيد.
چکيده
تحقيقات نشان داده است که اکثر مواد‌غذايي پروبيوتيکي حتي زماني که در دماهاي پايين نگهداري مي‌شوند تعداد پروبيوتيک‌هاي آن‌ها کم مي‌شود و اين امر باعث ميشود تعداد آنها در زمان مصرف کمتر از حد لازم باشند (CFU/g107). روشهاي مختلفي براي افزايش مقاومت باکتريهاي حساس پروبيوتيک پيشنهاد شده که از آن جمله مي‌توان به ريز‌پوشاني اشاره کرد. در تحقيق حاضر، سلولهاي سويهي بومي لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 که يک پروبيوتيک شناخته شده است، توسط صمغ فارسي و به روش امولسيون دوگانه پوشش داده شد و در بستر ماست اضافه شد. خصوصيات ظاهري اين ريزپوشينهها توسط ميکروسکوپ نوري مورد بررسي قرارداده شد. ميزان بقاء اين باکتري به دو صورت آزاد و پوشش داده شده با صمغ فارسي در بستر ماست و به صورت جداگانه در مدت 21 روز نگهداري در دماي 4 درجه سانتيگراد بررسي شد. طي اين مدت تغييرات pH واسيديته نمونهها، خواص حسي، ويسکوزيته و سفتي نمونههاي ماست حاوي سلول‌هاي پوشش داده شده و آزاد نيز مورد بررسي قرار گرفت. در انتهاي دورهي نگهداري مشخص شد که اثر ريزپوشاني بر زنده ماني باکتريها معنيدار بوده است (05/0p<). در نمونهي حاوي ميکروب ريزپوشاني شده با صمغ فارسي طي 21 روز انبارماني در يخچال تنها 8/0 سيکل لگاريتمي از تعداد ميکروب وارد شده کاهش پيدا کرده بود و تعداد هنوز بيشتر از CFU/g107 بود. در شرايط شبيهسازي شده گوارش نيز اختلاف معناداري بين سلول ريزپوشينه و آزاد وجود داشت. pH و اسيديته تمامي نمونهها تغيير معني‌داري در روزهاي اوليه داشت. ميزان ويسکوزيته در طول زمان نگهداري کاهش پيدا کرد و در همين مدت زمان، سفتي بافت افزايش پيدا کرد. خواص حسي نمونه ماست حاوي پروبيوتيک ريزپوشانيشده داراي اختلاف معني‌داري با نمونه شاهد بود. به طور کلي نتايج اين پژوهش، روش امولسيون دوگانه و صمغ فارسي را پوشش دهنده مناسبي براي باکتري پروبيوتيک لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 در بستر ماست معرفي کرد و مشخص شد که اين روش ميتواند از جمله راهکارهايي براي افزايش بقاء اين باکتري در نظر گرفته شود.
کلمات کليدي: لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7، پروبيوتيک،‌ ريزپوشاني، امولسيون دوگانه، صمغ فارسي، ماست، محيط شبيهسازي شده گوارشي
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه و كليات
1-1- مقدمه و اهميت موضوع2
1-2- تعريف مسئله4
1-3- اهداف5
1-4- فرضيات5
فصل دوم: بررسي منابع
2-1- غذاهاي فراسودمند8
2-2- فراورده هاي غذايي فراسودمند حاوي ميکروب‌هاي پروبيوتيک8
2-3- ماست پروبيوتيک9
2-4- پروبيوتيک‌ها10
2-4-1- معيار انتخاب ميکروارگانيسم به عنوان پروبيوتيک11
2-4-2- اثرات سودمند پروبيوتيک‌ها12
2-5- گونه‌هاي شناخته شده پروبيوتيک‌ها14
2-5-1- گونه لاکتوباسيلوس پلانتاروم15
2-5-2- لاکتوباسيلوس پلانتاروم A715
2-6- فرايند ريزپوشاني16
2-6-1- ريزپوشاني پروبيوتيک‌ها19
2-6-2- ساختمان ريزپوشينه20
2-6-3- انواع روش‌هاي ريزپوشاني21
2-6-4- استفاده از روش امولسيون به منظور ريزپوشاني پروبيوتيک‌ها23
2-6-5- کاربرد امولسيون‌هاي چند گانه در توسعه مواد غذايي سالم25
فهرست مطالب
عنوان صفحه
2-6-6- کاربرد امولسيون دوگانه در ريزپوشاني ميکروارگانيسم‌ها26
2-6-7- سورفاکتانت‌ها27
2-7- مواد مصرفي براي ريزپوشينه‌دار کردن29
2-7-1- صمغ‌هاي ژلان و زانتان29
2-7-2- ژلاتين30
2-7-3- نشاسته30
2-7-4- کاراگينان30
2-7-5- سلولز استات فتالات31
2-7-6- کيتوزان31
2-7-8- آلژينات31
2-7-9- صمغ فارسي32
2-8- مروري بر تحقيقات انجام شده در زمينه ارزيابي بقاء باکتري‌هاي پروبيوتيک ريزپوشينه شده طي نگهداري در ماست34
2-9- مروري بر تحقيقات انجام شده در زمينه ارزيابي ميزان بقاء باکتري‌هاي پروبيوتيک ريزپوشاني شده نسبت به شرايط شبيه‌سازي شده گوارشي35
2-10- هدف از انجام پژوهش37
فصل سوم: مواد و روش‌ها
3-1- معرفي تجهيزات، موادو ميکروارگانيسم‌هاي مورد استفاده40
3-1-1- تجهيزات مورد استفاده40
3-1-2- مواد شيميايي41
3-1-3- ميکروارگانيسم مورد استفاده43
فهرست مطالب
عنوان صفحه
3-2- عمليات ميکربي44
3-2-1- فعال سازي و نگهداري باکتري پروبيوتيک44
3-2-2- آزمون‌هاي بيوشيميايي به منظور شناسايي باکتري لاکتوباسيلوس پلانتاروم A745
3-3- آناليز شيميايي شيرخشک بدون چربي و صمغ فارسي46
3-3-1- اندازه‌گيري خاکستر46
3-3-2- اندازه‌گيري رطوبت و ماده خشک46
3-3-3- اندازه‌گيري چربي47
3-3-3-1- روش سوسكله47
3-3-3-2- روش ژربر47
3-3-4- اندازه‌گيري پروتئين و ازت کل47
3-3-5- اندازه‌گيري اسيديته برحسب اسيد لاكتيك48
3-5- رسم منحني رشد48
3-6- تهيه سوسپانسيون فعال سلولي جهت ريزپوشاني49
3-7- فرايندهاي ريزپوشاني49
3-8- آناليز رهايش سلول‌ها از ريزپوشينه‌ها50
3-9- محاسبه‌ي بازده فرايند ريزپوشاني50
3-10- بررسي مورفولوژي ريزپوشينه‌ها توسط ميکروسکوپ نوري51
3-11- تهيه‌ي ماست پروبيوتيک و ارزيابي خصوصيات ميکروبيولوژيکي، فيزيکي و حسي نمونه‌هاي ماست51
3-11-1- تهيه ماست پروبيوتيک51
3-11-2- آزمون‌هاي انجام شده بر روي ماست53
3-11-3- ارزيابي ميزان بقا پروبيوتيک‌ها درطول دوره نگهداري ماست54
فهرست مطالب
عنوان صفحه
3-12- بررسي ميزان بقاء سلول‌هاي آزاد و ريزپوشينه شده در محيط شبيه‌سازي شده گوارشي54
3-13- آماده‌سازي عصاره‌هاي شبيه‌سازي شده گوارشي55
3-14- ارزيابي پايداري سلول‌هاي آزاد و ريزپوشينه شده در شرايط شبيه‌سازي شده گوارشي55
3-15- ارزيابي حسي55
3-16- آناليز آماري داده‌ها56
فصل چهارم: نتايج و بحث
4-1- آزمون‌هاي بيوشيميايي58
4-2- آزمون‌ها و بررسي‌هاي شيميايي62
4-2-1- شيرخشک62
4-2-2- صمغ فارسي63
4-3- منحني رشد باکتري لاکتوباسيلوس پلانتارومA764
4-4- فرايندهاي ريزپوشاني و پوشش‌دهي65
4-4-1- شکل ريزپوشينه‌هاي توليد شده65
4-5- ميزان بقاء سلول‌هاي ريزپوشينه شده لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 در طي دوران نگهداري در دماي 4 درجه سانتي گراد66
4-6- ميزان بقا سلول‌هاي آزاد و ريزپوشينه شده لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 در ماست در طول نگهداري67
4-7- نتايج ارزيابي مقاومت سلول‌هاي آزاد و ريزپوشينه شده لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 در ماست، قبل و بعد از افزودن به ماست در شرايط شبيه‌سازي شده گوارشي70
4-8- ارزيابي آزمون هاي شيميايي ماست طي زمان نگهداري74
4-8-1- تغييرات pH74
فهرست مطالب
عنوان صفحه
4-8-2- تغييرات اسيديته بر حسب اسيدلاکتيک در نمونه‌هاي ماست75
4-9- ارزيابي آزمون‌هاي فيزيکي و کيفي ماست طي زمان نگهداري77
4-9-1- تغييرات گرانروي77
4-9-2- تغييرات سفتي و نفوذ ناپذيري بافت ماست78
4-10- ارزيابي خصوصيات حسي ماست79
فصل پنجم: نتيجه‌گيري
5-1- جمع بندي نتايج کلي82
5-2- پيشنهادات83
منابع86
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول 2-1- تعاريف مختلف ارائه شده پروبيوتيک در گذر زمان13
جدول 2-2- باکتري‌هاي لاکتيک اسيد پروبيوتيک15
جدول 2-3- انواع روش‌هاي ريزپوشاني22
جدول 3-1- اجزاي سازندهي محيط کشت MRS مايع42
جدول 3-2- جدول نظرسنجي خصوصيات حسي نمونه‌هاي ماست56
جدول 4-1- نتايج آزمون‌هاي بيوشيميايي باکتري لاکتوباسيلوس پلانتاروم A759
جدول 4-2- نتايج آزمون‌هاي بيوشيميايي باکتري لاکتوباسيلوس پلانتاروم60
جدول 4-3- مشخصات ظاهري پرگنه و سلول‌ باكتري باکتري لاکتوباسيلوس پلانتاروم A761
جدول 4-4- نتايج آزمون‌هاي بيوشيميايي مشخصات ظاهري پرگنه سويه‌هاي آغازگرها61
جدول 4-5- نتايج آزمون‌هاي شيميايي شيرخشک62
جدول 4-6- نتايج آزمون‌هاي شيميايي صمغ فارسي63
جدول 4-7- نتايج آزمون هاي شيميايي نمونه‌هاي ماست63
جدول 4-8- ريزپوشاني لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 برروي بقاي سلول‌ها در زمان نگهداري در دماي 4 درجه در مدت 21 روز66
جدول 4-9- بقا سلول‌هاي آزاد و ريزپوشينه شده لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 در ماست طي دوران نگهداري در مدت 21 روز67
جدول 4-10- بقا تيمارهاي مختلف لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 قبل و بعد از قرارگرفتن در شرايط اسيدي (HR24)71
جدول 4-11- بقا تيمارهاي مختلف لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 قبل و بعد از قرارگرفتن در شرايط صفراوي (HR24)71
جدول 4-12- تغييرات pH نمونه‌هاي ماست در مدت زمان انبارماني74
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول 4-13- تغييرات اسيديته بر حسب اسيدلاکتيک نمونه‌هاي ماست در مدت زمان انبارماني76
جدول 4-14- ويسکوزيته ظاهري (سانتيپوز) نمونه‌هاي ماست در مدت زمان انبارماني77
جدول 4-15- سفتي (گرم) لخته ماست در مدت زمان انبارماني78
جدول 4-16- مقايسه ميانگين خواص ارگانولپتيک نمونه‌هاي ماست79
فهرست شكل‌ها
عنوان صفحه
شکل 2-1- جزيئات ساختاري ريزپوشينهها21
شکل 2-2- تصوير شماتيک از ساختار امولسيون دوگانه23
شکل 2-3- ساختمان آلژينات32
شکل 3-1- فرايند توليد ماست52
شکل 4-1- منحني رشد لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 در محيط کشت MRS64
شکل 4-2- تصوير حاصل از ميکروسکوپ نوري (400×) ريزپوشينههاي توليدي توسط امولسيون دوگانه65

فصل اول
مقدمه و کليات
1-1- مقدمه و اهميت موضوع
نقش ترکيبات فعال رژيم غذايي در تغذيه انسان، يکي از مهمترين مسائل مورد توجه و تحقيق در زمينه علم تغذيه است. يافتههاي پژوهشي در مورد اين موضوع، پيامدهاي گستردهاي براي مصرف‌کنندگان، مسئولان بهداشتي، متخصصان تغذيه و همچنين توليدکنندگان، فرآيندکنندگان و توزيعکنندگان موادغذايي داشته است. شواهد علمي جديد در مورد فوايد و خطرات مرتبط با جنبههاي منحصر به فرد ترکيبات رژيمغذايي، به طور مداوم در حال ظهور و پيشرفت ميباشند. اثرات بالقوه مواد مغذي و اجزاي ديگر در رژيمغذايي، منجر به تحقق ايده توليد مواد غذايي با ويژگيهاي خاصي شده است که فراتر از برآوردن نيازهاي اساسي تغذيهاي، بر عملکرد بدن نيز مؤثر باشند. اين عامل توجيهکنندهي علاقهي زياد مردم به غذاهاي فراسودمند1 است (بورگاين و همکاران، 2006).
موادغذايي که به طور رضايتبخشي باعث بهبود وضعيت سلامت و يا کاهش خطر ابتلا به بيماريها، ميشوند را غذاهاي فراسودمند مي نامند. اين محصولات در حال حاضر، بازار رو به رشدي داشته و يکي از زمينههاي اصلي فعاليت در توليد محصولات جديد است. از آنجايي که مصرف‌کنندگان بيش از پيش به دنبال غذاهاي سالم با ارزش بالاتري هستند، محصولات موفقتر آنهايي هستند که ميتوانند ادعا کنند داراي فوايد سلامتيبخش بيشتري هستند. از آنجا که اثرات مفيد مواد غذايي تابعي از ترکيبات فعال در رژيم غذايي (اجزاي فراسودمندا) ميباشد، طراحي و توسعه اين غذاها نياز به روشهايي براي تعريف و بهينهسازي حضور آنها دارد، چه با افزايش سهم ترکيبات اوليه با اثرات مفيد و چه با محدود کردن ترکيباتي که داراي پيامدهاي منفي براي سلامتي هستند.
از گذشته غذا نه تنها به عنوان عامل تامينکننده انرِژي بدن انسان بوده است بلکه به عنوان عاملي براي افزايش سلامت مصرفکننده نيز، مورد استفاده قرار ميگرفته است. بنابراين، امروزه تحقيقات علم تغذيه، در مواردي از جمله دريافت بهينه مواد مغذي، شناسايي اجزاي با کيفيت در ترکيبات موادغذايي و توسعه غذاهايي جديد با عملکرد جديد که همان نقش ترکيبات غذايي در پيشگيري از بيماريها با تعديل سيستمهاي فيزيولوژيکي است، توسعه يافته است.
اولين تعريف غذاهاي فراسودمند را به بقراط نسبت ميدهند با شعار غذا را داروي خود کنيد (رياض. م، 1999). بعد از آن اولين بار در سال 1980، ژاپن غذاهايي را که با هدف ارتقاء سلامت مصرفکننده توليد و فراوري مي‌شد، فراسودمند ناميد (شاه و همکاران، 2000). امروزه غذاهاي فراسودمند به صورت زير تعريف ميشوند، محصولات غذايي که علاوه بر ارزش تغذيهاي معمول، مزاياي خاص ديگري هم براي سلامتي دارند و يا غذاهايي که حاوي سطوحي از ترکيبات زيست فعال ميباشند که به ارزش غذايي معمول محصول اضافه ميکنند (نازار و همکاران، 2009).
اين روزها مردم علاقه به مصرف غذاهاي سالمتر، بدون تغيير اساسي در رژيم غذايي خود دارند. اين بيعلاقگي مصرفکنندگان نسبت به تغيير عادات غذايي پيشنهاد ميدهد که بازار بالقوهاي براي غذاهايي وجود دارد که ارزش تغذيهاي آنها عوض شده است، ولي خواص حسي آنها تغيير نکرده است (رياض و همکاران، ‌1999). علاوه بر اين علاقه مردم به مصرف غذاها و يا مکملهاي غذايي که به بهبود ميکروفلور روده کمک ميکند، بيشتر شده است (ساندوال و همکاران، 2010). در اين ميان غذاهاي پروبيوتيک مهمترين غذاهاي ارتقاء دهنده سلامت مصرفکننده ميباشند و در سالهاي اخير آگاهي مردم نسبت به اينکه مصرف پروبيوتيکها اثرات مفيدي بر سلامتي دارد، افزايش يافته است (چمپاجن و همکاران، 2007). استفاده از پروبيوتيکها در غذاهاي فراسودمند و صنايع دارويي رشد زيادي داشته است، به طوريکه 65 درصد از بازار غذاهاي فراسودمند را به خود اختصاص داده‌اند (آگوست، 2006). موادغذايي نسبت به داروها حامل بهتري براي پروبيوتيکها محسوب ميشوند زيرا مصرفکنندگان تمايل بيشتري به مصرف غذاهاي سودمند نسبت به داروها دارند و غذاي پروبيوتيک ارزش غذايي بيشتري نسبت به داروي حاوي پروبيوتيک دارد.
باکتريهاي پروبيوتيک به اين صورت تعريف ميشوند؛ ميکروارگانيسمهاي زندهي غير بيماريزايي، که وقتي به مقدار کافي مصرف شوند اثرات مفيدي بر سلامت ميزبان (که ميتواند انسان يا دام باشد) خواهند داشت (دلا پورتا و همکاران، 2012؛ پيکوت و همکاران، 2000). امروزه محصولات پروبيوتيکي از قبيل سويا، آبپرتقال، محصولاتي بر پايهي غلات و حتي شکلات پروبيوتيک در بازار عرضه ميشوند (رودگرز. س، 2011).
عواملي موجب کاهش زندهماني پروبيوتيکها در موادغذايي ميباشند مثل pH نامطلوب، دما، پتانسيل اکسيداسيون – احيا و توليد هيدروژن پراکسيد (چاواري و همکاران، 2010؛ آلان و همکاران، 2010)، در نتيجه در بسياري از محصولات به هنگام مصرف تعداد باکتري به اندازه مطلوب باقي نمانده است. همچنين اسيد معده و قلياي روده هم در زندهماني باکتريها موثر است (کاپلا و همکاران، 2007). روشهاي مختلفي براي افزايش مقاومت باکتريهاي پروبيوتيک حساس پيشنهاد شده از جمله آنها ميتوان به انتخاب سويههاي مقاوم به اسيد معده، استفاده از بستهبندي غيرقابلنفوذ به اکسيژن يا استفاده از موادي که اکسيژن را مصرف ميکنند مثل آسکوربيک اسيد، ايجاد سازش با استرس، دو مرحلهاي کردن تخمير (اگر محصول تخميري است)، الحاق باکتري به ريزمغذيها مثل اسيدهاي آمينه و پپتيدها و ريزپوشاني اشاره کرد (آلان و همکاران، 2010).
ريزپوشاني2 فرايندي است که سلولها در شبکه ريزپوشينه يا در يک غشا قرار ميگيرند. يک ريزپوشينه شامل غشايي نفوذ ناپذير يا نيمه نفوذپذير، کروي، نازک و محکم است که اطراف هستهي مايع/جامد را پوشانده است که قطر آن بين يک ميليمتر تا چند ميکرون متغير است. پليمرهاي غذايي مثل آلژينات، کيتوزان، کربوکسي متيل سلولز، کاراگينان، ژلاتين و صمغها از جمله صمغ فارسي و صمغ عربي به طور عمده و با روشهاي مختلف در ريزپوشاني استفاده ميشوند. چون جمعيت سلولها طي فرايند ريزپوشاني تحت تاثير قرار ميگيرد، ضروري است که اطمينان حاصل شود که تکنيک ريزپوشاني تاثير منفي بر جمعيت سلولي ندارد.
يک روش جايگزين براي حفاظت از باکتريهاي پروبيوتيک وارد کردن آنها به امولسيون آب در روغن در آب است. امولسيون دوگانه احتمالا محافظ مناسبي براي باکتريها هنگام عبور آنها از محيط معده است و به عنوان کپسولي زيستي3 براي ريزپوشاني باکتريها براي مصارف صنعتي در صنعت لبنيات استفاده ميشود (گنزالس و همکاران).
1-2- تعريف مسئله
با توجه به نقش ريزپوشاني در افزايش بقاء ميکروارگانيسمها، و با در نظر گرفتن اينکه محصولي پروبيوتيک است که به تعداد لازم ( cfu/ml107) به سلولهاي اپيتليال روده برسد، نشان از وجود لزوم پرداخت به اين موضوع است و سوالات زير در ذهن تداعي ميشود:
1.آيا فرايند ريزپوشاني توسط زدو باعث حفظ و نگهداري لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 در ماست مي‌شود؟
2.آيا فرايند ريزپوشاني توسط زدو باعث حفظ و نگهداري لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 در محيط شبيهسازي شده گوارشي ميشود؟
1-3- اهداف
يکي از اهداف اين تحقيق بررسي اثر محافظتکنندهي ريزپوشينههاي آماده شده به روش امولسيوني آب در روغن در آب صمغ فارسي بر زندهماني باکتري پروبيوتيک لاکتوباسيلوس پلانتاروم A74 در بستر ماست و نگهداري امولسيون بدون اضافه کردن به ماست در دماي C?4 است. در اين تحقيق براي اولين بار اثر محافظتکنندگي ريزپوشينههاي توليد شده با استفاده از صمغ فارسي بر زندهماني باکتري پروبيوتيک لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 در بستر ماست و شرايط شبيهسازي شده گوارشي مورد بررسي قرار گرفته است.
1-4- فرضيات
در اين پروژه دو فرضيه مدنظر ميباشد:
1. ترکيباتي که به عنوان پوشش براي ريزپوشاني مورد استفاده قرار ميگيرند، ميتوانند با محافظت از باکتري سبب افزايش مقاومت باکتري در ماست شوند.
2. ترکيباتي که به عنوان پوشش براي ريزپوشاني مورد استفاده قرار ميگيرند، ميتوانند با محافظت از باکتري سبب افزايش مقاومت باکتري در محيطهاي شبيهسازي شده گوارشي شود.
فصل دوم
بررسي منابع
2-1- غذاهاي فراسودمند5
در دنياي امروز، مصرفکنندگان غذا را فراتر از طعم و ارزش تغذيهاي ميدانند و به عنوان عاملي که داراي فوايد مشخص براي سلامتيشان است، در نظر ميگيرند. از همينرو مبحث غذاهاي فراسودمند مطرح شده است (آنال و همکاران، 2007).
به طور کلي غذاهاي فراسودمند بايد داراي دو دسته مواد، شامل مواد مغذي پايه6 و مواد فعال از نظر فيزيولوژيکي باشند. دسته دوم جزئي است که به منظور فراسودمندکردن غذا به آن افزوده ميشود، که ميتواند به اشکال مختلفي از قبيل درشت مغذي مثل نشاسته، ريز مغذي مثل ويتامينها، غير مغذي مثل ميکروارگانيسمهاي زنده يا فاقد ارزش غذايي مثل اليگوساکاريدها باشد (رابرفرويد. م، 200). در سالهاي اخير، با افزايش سطح آگاهي مردم در رابطه با اثر بخشي غذاهاي فراسودمند، بخش عمده‌اي از بازار غذا به اين گروه اختصاص يافته است.
در کل غذاهاي فراسودمند به دو شکل توليد ميشود:
1- اجزاء مورد استفاده در غذاهاي فراسودمند از منابع طبيعي تغليظ و جداسازي شده باشند و سپس به منظور توليد فراوردههاي غذايي فراسودمند جديد، به آنها افزوده شود.
2- سطح ترکيبات فراسودمند موجود در يک ماده غذايي را تا حد تاثيرگذار، افزايش ميدهند (سيبل. ا، 2007).
2-2- فراوردههاي غذايي فراسودمند حاوي ميکروارگانيسمهاي پروبيوتيک
برخي غذاهاي فراسودمند با هدف بهبود تعادل و فعاليت فلور ميکروبي روده توليد ميشوند که غذاهاي حاوي ميکروارگانيسمهاي پروبيوتيک7 نام دارند (موسيلهي. س، 2003).
معمولا پروبيوتيکها به صورت طبيعي در غذا وجود ندارند و زمان زيادي است که اين ميکروارگانيسمها به صورت مکملهاي خوراکي، به منظور پيشگيري يا درمان بيماريها مورد مصرف قرار ميگيرند و در سالهاي اخير ايده افزودن ميکروارگانيسمهاي پروبيوتيک به موادغذايي مطرح شده است.
به صورت کلي مواد غذايي نسبت به داروهاي مکمل گزينه مناسبتري براي رساندن باکتريهاي پروبيوتيک به بدن انسان به شمار ميروند، به دلايلي از جمله اينکه مردم به مصرف غذاهاي حاوي ميکروارگانيسمهاي پروبيوتيک بيشتر از داروهاي مکمل تمايل نشان ميدهند و اينکه کيفيت تغذيهاي اين غذاها بيشتر از قرصهاي حاوي پروبيوتيک است. همچنين ترکيبات سازنده مواد غذايي پايداري ميکروارگانيسمهاي پروبيوتيک در دستگاه گوارش را بالاتر ميبرد(ووقان و همکاران، 1999).
2-3- ماست پروبيوتيک
تخمير يکي ار قديميترين روشهايي است که جهت تبديل شير به محصولاتي با عمر انبارماني بالاتر انجام ميشود. پيداکردن منشإ دقيق پيدايش شيرهاي تخمير شده مشکل است ولي تاريخ آن به 10 الي 15 هزار سال پيش بر ميگردد. در آن زمان شيوه زندگي انسان از حالت جمعآوري خوراک به حالت توليد غذا تغيير يافت (پدرسون. س، 1979). اگرچه هيچ نوشتهاي راجع به منشأ ماست وجود ندارد ولي اثرات سلامتيبخش و تغذيهاي آن در بسياري از تمدنها از مدتها پيش وجود داشته و به احتمال زياد منشأ آن به خاورميانه بر ميگردد. سير تکاملي اين محصول تخمير شده طي گذشت زمان، با مهارتهاي آشپزخانهاي مردمان چادرنشين در سراسر جهان انجام گرفته است و امروزه محصولات شيري تخمير شده در بسياري از کشورها در مقياس وسيع توليد ميشود، اگرچه تعداد کمي از آنها شکل تجاري به خود گرفتهاند(تميم و همکاران، 2000).
در توليد تجاري ماست، مخلوطي از باکتريهاي اسيدلاکتيک لاکتوباسيلوس دلبروکي زيرگونه بولگاريکوس8 و استرپتوکوکوس ترموفيلوس9، به شير توليد ميشود.
طي تخمير ماست برخي از متابوليتهاي ميکروبي بهبود دهنده طعم و خصوصيات سلامتيبخش نيز توليد ميشوند. چنين ويژگيهايي با غنيسازي ماست به وسيله باکتريهاي پروبيوتيک افزايش مي‌يابد. لاکتوباسيلوسها و بيفيدوباکتريومها10 در محصولاتي مانند ماست باعث تسهيل جذب پروتئين شده و با کاهش pH معده يونيزاسيون مواد معدني را تشديد کرده و جذب املاحي مانند کلسيم، روي، آهن و فسفر را افزايش ميدهند (گمز و همکاران، 1999).
ماست يکي از بهترين بسترهاي غذايي براي وارد کردن پروبيوتيک است. رشد ضعيف کشتهاي پروبيوتيک در شير و نقص فراوردههاي نهايي از نظر خواص حسي ماست، باعث شد تا همزمان از کشتهاي سنتي و پروبيوتيک استفاده کنند. توليد مقادير قابل توجهي اسيد استيک طي دوران گرمخانهگذاري طولاني توسط بيفيدوباکتريومها ايجاد عطر و طعم پنيري در ماست در اثر فعاليت سويههاي پروتئوليتيک پروبيوتيک و عدم توليد حداقل مقدار استالدهيد لازم جهت ايجاد طعم ويژه ماست، از مهمترين نقصهاي ماستهاي توليد شده با کشتهاي پروبيوتيک هستند (گرادي و همکاران، 2005). بهترين راه براي بهبود طعم فراوردههاي پروبيوتيک، استفاده از ميکروارگانيسمهاي پروبيوتيک به عنوان کشت همراه11 با کشتهاي آغازگر اصلي ماست است (طاهري و همکاران، 1388)، زيرا کشتهاي آغازگر با توليد آمينواسيدها و کاهش پتانسيل اکسيداسيون – احيا، رشد باکتريهاي پروبيوتيک را بهبود ميبخشند و با توليد ترکيبات موثر بر عطر و طعم، مشکلات احتمالي عطر و طعم را برطرف ميکنند (گمز و همکاران، 1999).
انتشار گزارشهايي مبني بر عدم تحمل سويههاي آغازگر ماست در سيستم گوارشي، باعث شده است تا پروبيوتيکهاي انساني از ميان ميکروارگانيسمهاي غيربيماريزا که زيستگاه آنها اندامهاي گوارشي انساني ميباشد،‌ جداسازي و گزينش شوند که گروه عمدهاي از آنها را لاکتوباسيلوسها تشکيل ميدهند. کاربرد موفقيتآميز اين گروه از ميکروارگانيسمها در فراوردههاي تخميري،‌ به خصوص ماست، به مراتب گزارش شده است (ميرلوحي و همکاران، ‌1388).
2-4- پروبيوتيکها
نخستين بار واژه پروبيوتيک در سال 1965 توسط ليلي12 و استيلون13، به معناي حياتبخش از واژه يوناني پروبيوتيس گرفته شده است و از پروبيوتيک به معناي تشريح مواد تقويت کنندهي رشد مترشحه از ميکروارگانيسمها، که باعث تحريک رشد ساير ميکروارگانيسمها ميشوند، استفاده کردند. بنابراين تعريف پروبيوتيک از نظر مفهوم، نقطه مقابل آنتيبيوتيکها يا عوامل ضد حيات است (گمز و همکاران، 1999). بعدها توسط افرادي چون پارکر14 (1974) و فولر15 (1976) تغيير يافت و دستگاه گوارش به عنوان نقطه اثر پروبيوتيکها معرفي شد (وجداني و همکاران، 1382). اين تعاريف با تعاريف قبلي که بر روي اثرات متقابل پروبيوتيکها وميکروفلور روده تمرکز کرده بود،‌ متفاوت است. سادهترين تعريف براي پروبيوتيکها توسط فولر ارائه شد که پروبيوتيکها را ميکروبهاي زندهاي معرفي کرد که بر ميزبان اثرات سودمندي باقي ميگذارد، به اين صورت که تعادل ميکروبي روده را بهبود ميبخشند. اخيرا FAO و سازمان بهداشت جهاني16، پروبيوتيکها را اينطور تعريف کردند: ميکروارگانيسمهاي زندهاي هستند که وقتي به مقدار کافي يا در محلي خاص مصرف ميشوند يک يا چندين فايده مشخص را براي سلامتي ميزبان (که ميتواند انسان يا دام باشد) به همراه دارند. اين ميکروارگانيسمها بايد از نظر متابوليکي در محصول ثابت و فعال باقي بمانند و قبل از هضم زنده مانده و بتوانند خود را به سلولهاي اپيتليال روده برسانند و آثار سودمندي را در آن قسمت به جاي گذارند (آنال و همکاران، 2007). پروبيوتيک محدودهي گستردهاي از ميکروارگانيسمها را شامل ميشود که اکثرا باکتري هستند، اما بعضي مخمرها هم پروبيوتيک محسوب ميشوند (بورگين و همکاران، 2011؛ پيکوت و همکاران، 2007).
البته طي زمانهاي مختلف تعاريف متعددي براي پروبيوتيکها ارايه شده که در جدول 2-1 به بعضي از آنها اشاره شده است (ويدهالاکشمي و همکاران، 2009).
2-4-1- معيار انتخاب ميکروارگانيسم به عنوان پروبيوتيک
ميکرارگانيسمهايي که به عنوان پروبيوتيک انتخاب ميشوند داراي يکسري ويژگيهايي هستند. از جمله اين ويژگيها عبارتند از (گمز و همکاران، ‌1999؛ گراجک و همکاران، 2005؛ ماتيلا-سندهلما، 2002):
– بيماريزا نباشد و در بدن ميزبان مسموميت ايجاد نکند و نسبت به آنتيبيوتيکها مقاوم باشد.
– بايد از سويهي مشخص بوده و منشا انساني داشته باشد.
– براي مصارف انساني توانايي زندهماني در محصول را داشته و بتواند شرايط توليد ماده غذاي را تحمل کند و پايدار باشد.
– از نظر ژنتيکي پايدار باشد.
– نسبت به اسيد معده، ترکيبات صفراوي و آنزيمهاي گوارشي مقاوم بوده و قابليت اتصال به سلولهاي اپيتليال روده را داشته باشد.
قابل ذکر است که ويژگيهاي عملکردي ميکروارگانيسم، مهمتر از منشا پروبيوتيک بودن آن است.

2-4-2- اثرات سودمند پروبيوتيکها
اثرات مفيد پروبيوتيکها شامل کاهش شيوع اسهال، يبوست و سرطان روده، تنظيم سطح کلسترول، بهبود سوءهاضمه، بهبود سيستم ايمني و رقابت با پاتوژنها است. پروبيوتيکها از رشد ميکروارگانيسمهاي ناخواسته يا مسمومکنندهي غذا مثل سالمونلا نيز جلوگيري ميکنند که اين اثرات مفيد به دليل توليد اسيدهاي کوتاهزنجير (مثل اسيدلاکتيک، اسيداستيک و يا پروپيونيکاسيد) و باکتريوسين است. همچنين اين باکتريها به رشد باکتريهاي مفيد موجود در فلور روده نيز کمک مي‌کنند (خليل و همکاران، ‌1998؛ موتوکوماراسامي و همکاران، 2006).
اگر ميکروارگانيسم در زمان مصرف به اندازهي کافي وجود نداشته باشد که اين مقدار معمولاً cfu/ml 106 (موکاران و همکاران، 2009؛ وپيکوت و همکاران، 2004) يا cfu/ml107 است، مزاياي حاصل از وجود اين ميکروارگانيسمها به مصرفکننده نخواهد رسيد و اگر محصول خواص حسي مطلوب نداشته باشد، مصرفکننده آن محصول را مصرف نميکند (گوناسکاران و همکاران، 2007). در مورد حداقل تعداد ميکروارگانيسم زنده تا زمان مصرف برخي کشورها مثل آرژانتين، پاراگوئه و برزيل اين تعداد راcfu/ml 106 براي بيفيدوباکتريومها ميدانند ولي در ژاپن اين تعداد cfu/ml 107 است. همچنين فدراسيون بين المللي لبنيات17، اين مقدار را cfu/ml 107 اعلام کرده است (چان و همکاران، 2002؛ چاواري و همکاران، 2010؛ دلا و همکاران، 2012).

جدول 2-1- تعاريف مختلف ارائه شده پروبيوتيك در گذر زمان
منبعتعريفسالورجينپروبيوتيکها، ميکروارگانيسمهاي متضاد آنتيبيوتيکها هستند.1954ليلي و استيلولمادهاي که بوسيلهي يک ميکروارگانيسم ترشح شده و رشد سايرين را تحريک مي‌کند.1965فوجي و کوکترکيباتي که باعث مقاومت ميزبان به عفونت ميشوند ولي از رشد ميکروارگانيسمها در محيط آزمايشگاهي جلوگيري نميکنند.1973پارکرمواد و ميکربهايي که در تعادل ميکربي روده شرکت دارند.1974هاونار و هوييس اينتولديک يا چند نوع ميکروارگانيسم زنده که در صورت مصرف توسط انسان يا دام بوسيلهي بهبود ميکروفلور روده به ميزبان سود ميرسانند.1992شرزمينر و دورسمحصولي که شامل ميکروارگانيسمهاي زندهي مشخص در تعداد معين است و در ميکروفلور ميزبان تغييرات مثبت ايجاد ميکند.2001FAO/WHOميکروارگانيسمهاي زندهاي که زماني که به تعداد کافي مصرف شوند بر روي ميزبان اثرات مفيد دارد.2002
البته موانعي براي زندهماني پروبيوتيکها در محصول نهايي وجود دارد از جمله pHنامطلوب، دما، پتانسيل اکسايش – کاهش و توليد هيدروژن پراکسيد (چاواري و همکاران، ‌2010). در نتيجه در بسياري از محصولات بههنگام مصرف، تعداد باکتري مورد نظر به تعداد مطلوب باقي نمانده است. همچنين اسيد معده و قلياي روده هم در زندهماني باکتريها موثر است (کاپلا و همکاران، 2007). در نتيجه تقاضاي زيادي از صنعت براي تضمين پايداري اين ميکروارگانيسمها در غذا حين نگهداري وجود دارد، زيرا زندهماني آنها هم از جنبهي اقتصادي مهم است (وقتي پايداري بالا باشد به تعداد کمتري ميکروارگانيسم اوليه نياز است) و هم از جنبهي سلامتي اهميت دارد، زيرا هنگامي پروبيوتيک‌ها اثرات سودمند خود را بر ميزبان ميگذارند که به تعداد اشاره شده به سلولهاي اپيتليال روده برسند (ميرلوحي و همکاران، 1388).
2-5- گونههاي شناخته شده پروبيوتيکها
سويههاي پروبيوتيکي که معمولا استفاده ميشوند،‌ عمدتا متعلق به جنسهاي بيفيدوباکتريوم18 و لاکتوباسيلوس19 هستند، ولي سويههايي از جنسهاي لاکتوکوکوس20، انتروکوکوس،21 پروپيوني‌باکتريوم22 و مخمر ساکارومايسز نيز وجود دارد که پروبيوتيک محسوب ميشوند (ريورا، ‌2010). بيفيدوباکتريوم‌ها باکتريهاي گرم مثبتي هستند و ميتوانند در محدودهي pH بين 5/4 تا 5/8 رشد کنند و مهمترين مشخصهي آنها بيهوازي بودن آنهاست (آگوست و همکاران، 2006). لاکتوباسيلوسها بزرگترين گروه باکتريهاي لاکتيک اسيد هستند که شامل بيش از 50 سويهي مختلف است. آنها گرم مثبت هتروژن، ميلهاي، غيراسپورزا و کاتالاز منفي هستند. ميکروائروفيل يا بيهوازي هستند و در شرايط محيطي و متابوليکي متفاوتي ميتوانند رشد کنند. محصول اصلي حاصل از تخمير قند توسط آنها لاکتيک اسيد است (واسيلجويک،‌ 2008). لاکتوباسيلوسها اگزوپليساکاريد، پپتيدهاي ضدميکروبي و متابوليتهاي متفاوت ديگر هم توليد ميکنند. لاکتوباسيلوسها در بيشتر موارد به عنوان آغازگر در صنايع استفاده ميشوند (کونينقام و همکاران، 2000). تعدادي از باکتريهاي لاکتيک اسيدي که پروبيوتيک شناخته ميشوند در جدول 2-2 آمده است (ساندرس و همکاران، 1999):
جدول 2-2 باکتريهاي لاکتيک اسيد پروبيوتيک
Non-LacticsOthey LABBifidiobacterium spp.Lactobacillus spp.Bacilluse cereus toyoi””Enterococcus faecalisB. adolescentisL. acidophilusPropionibacterium freudenreichiiSporolactobacillus inulinusB. bifidumL. caseiB. infantisL. delbrueckii subsp. bulgaricusB. lactisL. gallinarumB. longumL. gasseriL. johnsoniiL. paracaseiL. plantarumL. reuteriL. rhamnosus
2-5-1- گونه لاکتوباسيلوس پلانتاروم
لاکتوباسيلوس پلانتاروم، باکتري بيهوازي اختياري است و در محيط داراي قند گلوکونات رشد کرده و گاز دياکسيد کربن توليد ميکند. رشد بهينه آن 35-30 درجه سانتيگراد است، در 15 درجه سانتيگراد هم رشد ميکند و در 45 درجه سانتيگراد قادر به رشد نيست. کلنيهاي آن صاف،‌ سفيد و يا زرد رنگ است. اين گونه به صورت طبيعي فلور ميکروبي بسياري از فراوردههاي تخميري گياهي، ‌گوشتي و لبني است. از نظر ظاهر، باکتريهاي ميلهاي و به اشکال منفرد،‌ دوتايي و يا زنجيرهاي وجود دارند. ازمزاياي لاکتوباسيلوس پلانتاروم ميتوان به کاهش نفخ و درد روده، کاهش احتمال ابتلا به اسـهال در کودکان، کاهش التهاب روده در افراد مستعد، کاهش درد در روده افراد حساس، اثرات مثبت بر روي سيستم ايمني کودکان مبتلا به HIV و کاهش عفونتهاي دستگاه گوارش اشاره کرد (دي-وريسا و همکاران، 2006).
2-5-2- لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7
در پژوهش حاضر از باکتري پروبيوتيک لاکتوباسيلوس پلانتاروم A7 با منشاء انساني به عنوان سويهي پروبيوتيک استفاده شد. اين سويه توسط ميرلوحي (1388) از مدفوع نوزادي ايراني جداسازي شد، اين محقق خصوصيات پروبيوتيکي اين سويه را بررسي کرد و به دلايل زير آن را يک سويهي پروبيوتيک معرفي کرد:
1- مقاومت به نمکهاي صفراوي و pH هاي پايين و شرايط گوارش دستگاه انسان.
2- اين باکتري از نظر توليد اگزوپليساکاريد و آبگزيري سطحي شبيه پروبيوتيکهاي تجاري عمل ميکند.
3- مقاومت سويه نسبت به آنتي بيوتيک.
4- توانايي توليد لاکتيک اسيد و ترکيبات ضد ميکربي (اکبري و همکاران، 1389).

2-6- فرايند ريزپوشاني
اکثر پروبيوتيکها حتي در زمان نگهداري در دماهاي پايين، عمر ماندگاري کمي داشته و باعث ميشود تعداد آنها در زمان مصرف کمتر از حد لازم باشد (چمپاژن. س، 2007). روشهاي مختلفي براي افزايش مقاومت باکتريهاي حساس پروبيوتيک پيشنهاد شده از جمله انتخاب سويههاي مقاوم به اسيد مناسب، افزايش تلقيح ميکروبهاي پروبيوتيک به مواد غذايي، افزايش پريبيوتيک به فراورده‌هاي غذايي، استفاده از بستهبندي غيرقابل نفوذ به اکسيژن يا استفاده از موادي که اکسيژن را مصرف ميکنند مثل آسکوربيک اسيد، ايجاد سازش با استرس، دو مرحلهاي کردن تخمير(اگر محصول تخميري است)، الحاق باکتري به ريزمغذيها مثل اسيدهاي آمينه و پپتيدها و ريزپوشاني پروبيوتيک (چاواري و همکاران، 2010؛ آنال-وجتاس و همکاران، 2008). ريزپوشاني23 فرايندي شيميايي-مکانيکي است که به معناي فن بستهبندي مواد جامد، مايع و گازي در ريزپوشينههاي کوچکي است که محتوياتش با سرعت کنترل شده طي مدت زماني مشخص آزاد ميشود. اين مفهوم توسط چانگ24 در اوايل دهه 60 به منظور حفاظت از موادزيستي مانند سلولهاي پيوندي، آنزيمها و برخي ترکيبات جاذب مطرح شد (پراکاش و همکاران، 2006).



قیمت: تومان


پاسخ دهید