معاونت پژوهش و فناوري
به نام خدا
منشور اخلاق پژوهش
باياري‌از خداوند سبحان ‌و‌اعتقاد به‌اين‌که ‌عالم محضرخداست ‌و همواره ‌ناظر بر اعمال ‌انسان و به‌منظور پاس داشت مقام بلنددانش ‌و‌پژوهش ‌و نظر به اهميت جايگاه دانشگاه در اعتلاي فرهنگ و تمدن بشري، ما دانشجويان و اعضاءهيات‌علمي واحدهاي‌دانشگاه‌آزاداسلامي متعهد مي‌گرديم اصول زيررا درانجام فعاليت‌هاي پژوهشي مدنظر قرار داده و از آن تخطي نکنيم:
1- اصل برائت: الترام به برائت‌جويي از هرگونه رفتار غيرحرفه‌اي و اعلام موضع نسبت به کساني که حوزه علم و پژوهش را به شائبه‌هاي غيرعلمي مي‌آلايند.
2- اصل رعايت انصاف و امانت: تعهد به اجتناب از هرگونه جانب‌داري غير علمي و حفاظت از اموال، تجهيزات و منابع در اختيار.
3- اصل ترويج: تعهد به رواج دانش و اشاعه نتايج تحقيقات و انتقال آن به همکاران علمي و دانشجويان به غير از مواردي که منع قانوني دارد.
4- اصل احترام: تعهد به رعايت حريم و حرمت‌ها در انجام تحقيقات و رعايت جانب نقد و خودداري ازهرگونه حرمت شکني.
5- اصل رعايت حقوق: التزام به رعايت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهيدگان (انسان، حيوان، نبات) و ساير صاحبان حق.
6- اصل رازداري: تعهد به صيانت از اسرار و اطلاعات محرمانه افراد، سازمان‌ها و کشور و کليه افراد و نهادهاي مرتبط با تحقيق.
7- اصل حقيقت جويي: تلاش در راستاي پي‌جويي حقيقت و وفاداري به آن و دوري از هرگونه پنهان سازي حقيقت.
8- اصل مالکيت مادي و معنوي: تعهد به رعايت کامل حقوق مادي و منعوي دانشگاه و کليه همکاران پژوهش.
9- اصل منافع ملي: تعهد به رعايت مصالح ملي و در نظر داشتن پيشبرد و توسعه کشور در مراحل پژوهش.
فرم تصويب پايان نامه
يرفع الله الذي آمنوا منکم والذين اوتوالعلم درجات
قرآن کريم
کارشناسي ارشد خانم سيده مريم شاکري با عنوان القاء موتاسيون نقطه‌اي با استفاده از EMS در گياه بادرنجبويه Melissa officinalis در جلسه مورخه13/6/92 تحت نظارت شوراي پايان نامه متشکل از استادان زير با درجه و نمره مورد تاييد قرار گرفت.
1- استاد راهنما: دکترسيدکمال کاظمي تبار امضاء
2- استاد مشاور: دکترجعفرمسعود سينکي امضاء
3- داور خارج از گروه: دکترمجيد معصوميان امضاء
دکتر شهرام رضوان بيدختي
معاون پژوهشي دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشکده‌کشاورزي
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد
رشته مهندسي کشاورزي بيوتکنولوژي کشاورزي
گرايش کشاورزي
عنوان
القاء موتاسيون نقطه‌اي با استفاده از EMS در گياه بادرنجبويه Melissa officinalis
استاد راهنما
دکترسيدکمال کاظمي‌تبار
استاد مشاور
دکترجعفرمسعودسينکي
نگارنده
سيده مريم شاکري
شهريور 1392
سپاسگزاري
با سپاس بيکران و شکر بي‌انتها به درگاه ذات اقدس الهي، که توفيق انجام اين رساله را به بنده حقير داد و با حمد و ثناي او که هر قدر زياد باشد، باز در مقابل لطف او اندکي بيش نيست.
سپاس بي‌کران پروردگار يکتا را که هستي‌مان بخشيد و به طريق علم و دانش رهنمون‌مان شد و به همنشيني رهروان علم و دانش مفتخرمان نمود و خوشه‌چيني از علم و معرفت را روزي‌مان ساخت.
هر چند واژه‌ها را ياراي آن نيست که لطف، محبت و بزرگواري کساني را که در تمام دوران زندگيم جرعه نوش درياي بي‌کران مهر و محبت‌شان بوده‌ام را به تصوير بکشم، به رسم ادب و احترام، بوسه بر دست‌شان زده و بر خود واجب مي‌دانم زحمات کليه اساتيد بزرگوارم را ارج نهاده و مراتب تشکر قلبي خويش را از الطاف و مهرباني‌هاي آن‌ها ابراز نمايم.
از زحمات، راهنمايي‌ها و مشاوره‌هاي ارزشمند اساتيد علم و ادب و اخلاق جناب آقاي دکتر سيدکمال کاظمي‌تبار و دکتر جعفر مسعودسينکي که با راهنمايي‌ها و نظرات گوهربار خود راه‌گشاي اينجانب بوده‌اند، کمال تشکر را دارم. بي‌شک انجام اين پژوهش بدون کمک فکري، همـکاري و همـدلي اين اساتيد متواضـع و انديشمند غيـر ممـکن مي‌نمود و همنشيني و شاگردي ايشان را که از بزرگترين افتخارات و شيرين‌ترين لحظات زندگي‌ام مي‌باشد، منت‌دار محبت‌هاي کارساز اين عزيزان هستم.
از صبر و بردباري استاد بزرگوارم دکترمجيد معصوميان که زحمت مطالعه و داوري اين پايان‌نامه را بر عهده داشتند بسيار سپاسگزارم.
از برادر عزيزم جناب آقاي مهندس امين صادقي و مهندس سعيد قريب بلوک به خاطر لطف‌هايي که در حق من کرده‌اند بي‌نهايت سپاس گزارم.
فهرست مطالبصفحهعنوان 1چکيده……………………………………………………………………………………………………………………….. فصل اول: مقدمه و کليات21-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………….41-1-1 اهميت موضوع…………………………………………………………………………………………………41-1-2 فرضيات………………………………………………………………………………………………………….51-1-3 اهداف پژوهش…………………………………………………………………………………………………51-1-4 ساختارپژوهش…………………………………………………………………………………………………61-2 کليات………………………………………………………………………………………………………………….61-2-1 گياه شناسي……………………………………………………………………………………………………..71-2-2 رويش و تکثير گياه…………………………………………………………………………………………..71-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار……………………………………………………………………………………. 71-2-4 نيازهاي اکولوژي………………………………………………………………………………………………81-2-5 اهميت دارويي…………………………………………………………………………………………………81-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس…………………………………………………………………………………91-2-7 استفاده‌ها…………………………………………………………………………………………………………91-2-8 کشت بافت گياهي……………………………………………………………………………………………111-2-8-1 تاريخچه کشت بافت گياهي…………………………………………………………………………..121-2-9 کاربردهاي کشت بافت گياهي…………………………………………………………………………….121-2-9-1 توليد مواد شيميايي……………………………………………………………………………………….121-2-9-2 ايجاد گياه عاري از عوامل بيماري‌زاي گياهي…………………………………………………… 121-2-9-3 ايجاد تنوع ژنتيکي………………………………………………………………………………………..121-2-9-4 کاربرد کشت بافت گياهي در کشاورزي،باغباني و جنگل‌داري…………………………….131-2-9-5 کاربردهاي اقتصادي کشت بافت گياهي…………………………………………………………..131-2-9-6 کاربردهاي کشت بافت گياهي در مهندسي ژنتيک و فناوري زيستي…………………….صفحهعنوان141-2-9-7 انواع کشت بافت گياهي………………………………………………………………………………..141-2-9-8 بررسي اثرات فاکتورهاي مختلف در محيط کشت…………………………………………….151-2-9-9 نمک‌هاي غيرآلي………………………………………………………………………………………….151-2-9-10 ويتامين‌ها…………………………………………………………………………………………………..161-2-9-11 هورمون‌هاي گياهي…………………………………………………………………………………….161-2-9-11-1 اکسين‌ها………………………………………………………………………………………………..171-2-9-11-2 سيتوکنين‌ها……………………………………………………………………………………………181-2-9-12 منبع انرژي…………………………………………………………………………………………………181-2-9-13 عوامل فيزيکي……………………………………………………………………………………………181-2-9-14 مواد آلي…………………………………………………………………………………………………….191-2-9-15 ريزنمونه……………………………………………………………………………………………………191-2-9-16 PH………………………………………………………………………………………………………….191-2-9-17 آب…………………………………………………………………………………………………………..201-2-9-18 آگار………………………………………………………………………………………………………….201-2-9-19 چگونگي انتخاب محيط کشت……………………………………………………………………..201-2-10 ريزازديادي گياهان از طريق کشت بافت…………………………………………………………….211-2-10-1 موارد استفاده از ريزازديادي…………………………………………………………………………221-2-11ريشه‌زائي………………………………………………………………………………………………………..221-2-12 تعريف موتاسيون (جهش)……………………………………………………………………………….221-2-12-1 تاريخچه استفاده از موتاسيون……………………………………………………………………….231-2-12-2 انواع موتاسيون…………………………………………………………………………………………..231-2-12-3 موتاژن………………………………………………………………………………………………………241-2-12-3-1 انواع موتاژن…………………………………………………………………………………………..241-2-12-3-2 عوامل شيميايي جهش‌زا…………………………………………………………………………..251-2-12-4 سطوح ايجاد موتاسيون………………………………………………………………………………..صفحهعنوان261-2-12-5 مواد گياهي مورد تيمار………………………………………………………………………………..261-2-12-6 اهميت موتاسيون در اصلاح نباتات……………………………………………………………….261-2-12-7 هدف موتاسيون مصنوعي…………………………………………………………………………….271-2-12-8 موفقيت موتاسيون………………………………………………………………………………………271-2-12-9 اصلاح به روش موتاسيون……………………………………………………………………………271-2-12-10 روش‌هاي جديد استفاده از موتاسيون………………………………………………………….281-2- 13اسانس گياهي…………………………………………………………………………………………………291-2-13-1روغن‌هاي اسانس………………………………………………………………………………………..301-2-13-2 جداسازي و شناسايي مواد تشکيل دهنده روغن اسانسي گياه……………………………فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده312-1 اثر موتاژن‌ها در ايجاد تنوع در صفات مختلف………………………………………………………….332-2 اثر موتاسيون اتيل متيل سولفانات در ايجاد تنوع در سطوح مختلف……………………………..382-3 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….فصل سوم: مواد و روش‌ها403-1 مواد گياهي…………………………………………………………………………………………………………..403-2 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….403-2-1 تهيه محلول ذخيره محيط‌هاي کشت……………………………………………………………………413-2-1-1 تهيه محلول ذخيره ماکرو……………………………………………………………………………….413-2-1-2 تهيه محلول ذخيره عناصر ميکرو…………………………………………………………………….433-2-1-3 تهيه محلول ذخيره آهن-سديم……………………………………………………………………….433-2-1-4 تهيه محلول ذخيره ويتامين…………………………………………………………………………….443-2-2 تهيه محيط کشت………………………………………………………………………………………………453-2-3 کار در اتاقک کشت بافت…………………………………………………………………………………..463-2-4 ضدعفوني وسايل آزمايشگاهي، محيط کشت و مواد گياهي……………………………………463-2-4-1 ضدعفوني نمونه‌هاي گياهي……………………………………………………………………………صفحهعنوان463-2-3-1 ضدعفوني اندام گياه……………………………………………………………………………………..473-2-5 تهيه ريزنمونه……………………………………………………………………………………………………473-2-6 بهينه سازي محيط کشت……………………………………………………………………………………473-2-7 بررسي نمونه‌هاي کشت شده…………………………………………………………………………….473-2-8 بازيافت کشت‌هاي آلوده……………………………………………………………………………………483-2-9 تيمارهاي مورد استفاده………………………………………………………………………………………483-2-9-1 روش تهيه استوک EMS …………………………………………………………………………….493-2-9-2 روش اعمال تيمارهاي EMS در گياه کشت بافتي……………………………………………493-2-9-3 روش اعمال تيمارهاي EMS در مزرعه………………………………………………………….503-2-9-4 روش شستشوي تيمارها………………………………………………………………………………..503-3 تهيه مواد گياهي براي اسانس‌گيري………………………………………………………………………….503-4 آناليز اجزاء اسانس………………………………………………………………………………………………..513-5 تجزيه داده‌هاي آماري…………………………………………………………………………………………… فصل چهارم: نتايج و بحث 524-1 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….554-2 تاثير EMS برروي خصوصيات مرفولوژيکي گياه…………………………………………………….564-2-1 ضريب همبستگي بين صفات و خصوصيات مورد بررسي……………………………………..564-2-2 اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد ريشه جانبي………………………………………………….574-2-3 اثر دوز EMS و زمان برروي طول ريشه…………………………………………………………….574-2-4 اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد ريشه……………………………………………………………584-2-5 اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد برگ…………………………………………………………….584-2-6 اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد جوانه…………………………………………………………..594-2-7 اثر دوز EMS و زمان برروي طول ساقه……………………………………………………………..604-2-8 اثر دوز EMS و زمان برروي متوسط طول برگ………………………………………………….604-3 استخراج اسانس……………………………………………………………………………………………………صفحهعنوان604-3-1 آناليز و شناسايي کمي و کيفي اجزاي موجود در اسانس…………………………………………614-3-2 نتايج مربوط به طيف کروماتوگرام گازي گياه……………………………………………………….624-3-3 ترکيبات تشکيل دهنده اسانس…………………………………………………………………………… فصل پنجم: نتيجه‌گيري635-1 بحث…………………………………………………………………………………………………………………..635-1-1 کشت بافت گياهي……………………………………………………………………………………………645-1-2 اثرات موتاژن EMS ……………………………………………………………………………………….685-2 نتيجه‌گيري…………………………………………………………………………………………………………..695-3 پيشنهادات……………………………………………………………………………………………………………70فهرست منابع فارسي…………………………………………………………………………………………………….74فهرست منابع انگليسي………………………………………………………………………………………………….86چکيده انگليسي……………………………………………………………………………………………………………
فهرست جداولصفحهعنوان جدول41جدول 3-1 جدول عناصر کم مصرف MS با غلظت X100…………………………………………….42جدول 3-2 ترکيبات محيط کشت پايه MS…………………………………………………………………….43جدول 3-3 جدول عناصر پرمصرف MS با غلظت X10…………………………………………………43جدول 3-4 محلول ذخيره آهن، ويتامين و اسيدهاي آمينه با غلظت X100………………………….51جدول 3-5 شرايط دستگاه GC-MS……………………………………………………………………………56جدول 4-1 ضريب همبستگي بين صفات و خصوصيات مورد بررسي در گياه بادرنجبويه…….56جدول 4-2 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي تعداد ريشه جانبي……………..57جدول 4-3 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي طول ريشه……………………….57جدول 4-4 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي تعداد ريشه………………………58جدول 4-5 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي تعداد برگ در ساقه……………58جدول 4-6 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي تعداد جوانه……………………..59جدول 4-7 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي طول ساقه………………………..60جدول 4-8 تجزيه واريانس اثر متقابل دوزEMS و زمان برروي متوسط طول برگ……………..62جدول 4-9 ميزان مواد موثره موجود در اسانس بادرنجبويه……………………………………………….
فهرست شکل‌هاصفحهعنوان شکل6شکل 1-1 شمائي از گياه کامل بادرنجبويه………………………………………………………………………16شکل 1-2 ساختار تعدادي از اکسين‌ها……………………………………………………………………………17شکل 1-3 ساختار تعدادي از سيتوکنين‌ها……………………………………………………………………….25شکل 1-4 ساختار شيميايي مواد جهش‌زا………………………………………………………………………..30شکل 1-5 دستگاه کروماتوگرافي گازيGC/MS……………………………………………………………61شکل 4-1 کروماتوگرام گازي اسانس بادرنجبويه……………………………………………………………..65شکل 5-1 مراحل رشد گياه در محيط پايه MS………………………………………………………………66شکل 5-2 مراحل رشد گياهان مورد تيمار موتاژن در محيط کشت…………………………………….67شکل 5-3 تيمار اعمال شده در مزرعه…………………………………………………………………………….81شکل الف-1 مراحل ضدعفوني گياه……………………………………………………………………………….82شکل الف-2 تهيه ريزنمونه……………………………………………………………………………………………82شکل ب-1کشت ريزنمونه و مراحل انجام کار………………………………………………………………..83شکل ب-2 نمونه هاي کشت شده قرارگرفته در ژرميناتور………………………………………………..83شکل ج-1 شستشوي تيمارهاي کشت بافتي از EMS……………………………………………………..84شکل ج-2 اعمال EMS در مزرعه………………………………………………………………………………..85شکل د-1 مراحل اسانس‌گيري………………………………………………………………………………………85شکل د-2 دستگاه روتاري…………………………………………………………………………………………….
فهرست نمودارهاصفحهعنوان نمودار52نمودار4-1 طول ساقه…………………………………………………………………………………………………..53نمودار4-2 طول ريشه…………………………………………………………………………………………………..53نمودار4-3 تعداد برگ در ساقه………………………………………………………………………………………54نمودار4-4 تعداد ريشه جانبي………………………………………………………………………………………..54نمودار4-5 تعداد جوانه در ساقه…………………………………………………………………………………….55نمودار4-6 متوسط طول برگ………………………………………………………………………………………..59نمودار4-7 اثر غلظت EMS برروي تعداد جوانه گياه بادرنجبويه………………………………………
فهرست علامت‌ها و اختصارها
معادل فارسيمعادل انگليسيعلامتاتيل متيل سولفاناتEthyl Methane SulfonateEMSکروماتوگرافي گازي توام با طيف سنجي جرميGas ChromatograpHy Mass SpectroscopyGC-MSاتيل اتان سولفاناتEthyl Ethane SulfonateEESبنزيل آدنينBenzyladenineBAبنزيل آمينوپورينBenzylaminopurineBAPايندول-3- استيک اسيدIndole3-acetic acidIAAايندول-3- بوتيريک اسيدIndole3-butric acidIBAنفتالين استيک اسيد1-NapHthaleneacetic acidNAA
چکيده
بادرنجبويه با نام علمي Melissa officinalis يکي از انواع گياهان دارويي مي‌باشد که به دليل توليد اسانس‌هاي با ارزش در صنايع داروسازي و بهداشتي استفاده‌هاي فراواني دارد. اين پژوهش با قرار دادن ريز نمونه‌هاي بادرنجبويه به محيط کشت درون شيشه‌اي MS انجام شد و هدف تکثير گياه از طريق کشت بافت براي استفاده از تاثير موثرتر ماده جهش‌زا و بدست آوردن نمونه‌هاي گياهي جديد موتانت شده هم از طريق کشت بافت و هم در محيط مزرعه و بررسي تغييرات ميزان مواد موثره اسانس موجود در گياه در اثر ماده جهش‌زاي اتيل متيل سولفانات (EMS) مي‌باشد. اين آزمايش هم بصورت مزرعه‌اي و هم بصورت آزمايشگاهي (کشت بافتي) مورد بررسي قرار گرفت. در تيمارهاي آزمايشگاه، سرشاخه‌هاي رشد يافته در محيط MS بدون هورمون را با غلظت‌هاي 0/0% (به عنوان شاهد)، 05/0% و 01/0% و 005/0% EMS و در مدت زمان‌هاي 24 و48 ساعت اعمال شدند. در قسمت مزرعه‌اي نيز از همين غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شدند. فاکتورهاي مختلف مورفولوژيک از قبيل طول ساقه، طول ريشه، تعداد جوانه در ساقه، تعداد ريشه رونده جانبي، طول برگ و تعداد برگ در ساقه مورد ارزيابي قرار گرفته و پاسخ معني‌داري را در سطح 5 درصد نشان دادند اين آزمايش نشان داد كه استفاده از مواد جهش‌زا در محيط کشت MS نقش بسزايي در تغيير مرفولوژيک اين گياه دارويي دارد. بهترين نتيجه نيز از کشت ريزنمونه‌هاي که شامل جوانه‌هاي جانبي و انتهايي بوده‌اند و تحت تيمار با غلظت 01/0% EMS بودند به‌دست آمد. آناليز اسانس تيمارها نيز انجام شد که نتيجه آن بي‌اثر بودن اين ماده اتيل متيل سولفانات روي مواد اجراء اسانس اين گياه بوده است.
کلمات کليدي: بادرنجبويه (Melissa officinalis)، کشت درون شيشه‌اي، محيط کشت MS، اتيل متيل سولفانات(EMS)، مواد موثره
فصل اول
مقدمه و کليات

1-1 مقدمه:
گياهان دارويي فراواني در کشور ما مي‌رويند که بسياري از آن‌ها داراي طيف وسيعي از خواص دارويي مي‌باشند و در بسياري از نقاط کشور رشد مي‌يابند. برهمين اساس بررسي و مطالعه گياهان دارويي ايران با استفاده از ابزارهاي امروزي ضروري به نظر مي‌رسد. در حال حاضر در قرن 21، طب گياهي از جايگاه خاصي برخوردار است به گونه‌اي که در اتحاديه اروپا قوانيني مبني بر لزوم انجام آزمايشات باليني برروي گياهان دارويي همانند داروهاي شيميايي وضع کرده است که بر اساس آن تمام داروهاي گياهي بايد مجوز دريافت نمايند. اولين استفاده از گياهان دارويي در خاورميانه و مربوط به عصر پارينه سنگي است. شواهد استفاده از گياهان دارويي توسط انسان به حدود شصت هزار سال پيش مي‌رسد.
گياهان به عنوان يکي از اجزاء طبيعت، از ديرگاه پشتوانه غني نيازهاي بشري بوده‌اند و مي‌توان با اطمينان گفت تا زماني که انسان در اين کره خاکي به سر مي‌برد، به گياهان نياز دارد (سليمان زاده، 1377).
در بحث گياهان دارويي، محدوديت‌هاي کاشت و نگهداري آن‌ها متعدد مي‌باشد که از آن جمله مي‌توان به کوتاه بودن فصل کاشت و يا برداشت بعضي از گونه‌هاي گياهي، کمبود زمين‌هاي مناسب جهت داشت، ناچيز بودن مواد موثره حاصل از گياه و غيره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوي، 1385).
يکي از راه‌هاي رفع اين محدوديت‌ها کشت بافت گياهي1 است. تکنيک‌هاي کشت بافت گياهي درحال حاضر به عنوان يک ابزار قوي جهت رفع مشکلات اساسي و کاربردي بيولوژي گياهي درآمده است.
استفاده از گياهان به عنوان دارو از زمان‌هاي خيلي دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود يک سوم داروهاي مورد استفاده داراي منشاء گياهي مي‌باشند. کشورهاي آسيايي بخصوص هند، چين و ايران سابقه بسيار طولاني دراين زمينه دارند. اين گياهان مواد زيستي بخصوص و فعال با مقادير بسيار کم توليد مي‌کنند که تحت عنوان متابوليت‌هاي ثانويه نام‌گذاري مي‌شوند.در عصر جديد، دانشمندان علوم گياهي با استفاده از آخرين تکنيک‌هاي عملي کشت بافت گياهي، توانسته‌اند از انواع گياهان ترکيب‌هاي بسيار مفيدي را جهت مداواي بيماري‌هاي سخت و غير قابل مداوا و موارد استفاده ديگر، بدست آورند. در طي چند دهه اخير روش‎هاي متفاوتي با استفاده از بيوتکنولوژي2 درزمينه پرورش محصولات گياهي برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ها مي‌توان روش‌هاي ايجاد گونه‌هاي جهش يافته3 و پلي پلوئيد4 را نام برد.
کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شيشه‌اي5 و يا کشت استريل نيز مطرح مي‌شود، ابزاري مهم در مطالعات پايه و کاربردي بوده و داراي کاربردهاي تجاري است (رجب بيگي و همکاران، 1385؛ سونانداکوماري و همکاران6، 2003). يکي از اين کاربردها امکان ايجاد گياهان ترانسژنيک با وارد کردن DNA تقريبا از هر منبع ديگري مي‌باشد. شايد اولين قدم در زمينه کشت بافت گياهي در سال 1756 توسط هنري لوئيس داهامل برداشته شد، زماني که وي شاهد تشکيل کالوس7 در حين مطالعه مواد التيام دهنده زخم‌هاي گياهي بود (غضنفري8، 1994).
اساس تئوري کشت بافت گياهي توسط گتليت هابرلنت از آکادمي علوم آلمان در سال 1902، بعد از آزمايش هاي وي روي کشت تک سلول ها پيشنهاد گرديد (هابرلنت9، 1902). توسعه روش‌هاي کشت بافت و زيست‌شناسي مولکولي براي تبادل DNA بين موجودات زنده غير خويشاوند اين امکان را مي‌دهد که ژن‌هاي جديدي از موجودات زنده خارج از سلسله گياهي به درون گياهان گيرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر مي‌تواند کمکي جهت بررسي و واکنش‌هاي گياه بادرنجبويه نسبت به تکنيک‌هاي مختلف کشت بافت و باززائي اين گياه از طريق کشت بافت و اثر مواد جهش‌زائي همچون اتيل متيل سولفانات10 (EMS) باشد، تا محققين ديگر بتوانند به مطالعه خواص دارويي يا تغييرات لازم در مواد موثره يا فعال (متابوليت‌هاي ثانويه) و يا مطالعات انتقال ژن در اين گياه بپردازند.

1-1-1 اهميت موضوع
براي انجام کشت بافت بادرنجبويه (Melissa officinalis L) از بخش‌هاي مختلف گياه مانند ريشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماري و همکاران، 2003؛ ساجانا و همکاران11، 2011). با توجه به اينکه روش معمول اصلاح و بهبود توليد متابوليت‌هاي ثانويه در گياهان دارويي شامل کاشت آن‌ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج اين مواد به روش‌هاي شيميايي و غيره با مشکلات متعددي نظير شرايط محيطي و زراعي، صرف زمان، هزينه و استفاده نيروي کار زياد و همچنين خطرنابودي برخي از گياهان دارويي کمياب روبرو است، استفاده از روش‌هاي نوين از جمله کشت درون شيشه‌اي (in vitro) ضرورت مي‌يابد به همين منظور اولين بار در سال 1976 توسط زنيک تکنيک کشت سوسپانسيون سلول هاي گياهي حاوي متابوليت‌هاي ثانويه انجام گرفت. البته در ارتقاء بيوسنتز متابوليت‌هاي دارويي در شرايط درون شيشه‌اي اغلب، گياهاني انتخاب مي‌شوند که بازده توليد متابوليت‌هاي با ارزش در آن‌ها بالا باشد (باقري و صفاري، 1387).
بادرنجبويه به عنوان يک گياه دارويي شناخته مي‌شود (اميدبيگي ،1386؛ هوشيار قيصر،1388). تاکنون مطالعات زيادي در مورد تعيين مواد موثره بادرنجبويه صورت گرفته است (رجحان،1362؛ زرگري،1369؛ مومني وشاهرخي،1377؛ آزادبخت،1378). موارد مصرف و خواص دارويي آن نيز به خوبي مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ايجاد جهش زياد نبوده است. همچنين با در نظر گرفتن اهميت و خواص دارويي اين گياه، مطالعات کشت بافت، بهينه‌سازي محيط کشت جهت اهداف مختلف، مطالعه متابوليت‌هاي ثانويه ،انتقال ژن و مهندسي ژنتيک براي اين گياه ضرورت دارد.

1-1-2 فرضيات
* کشت بافت يکي از راه‌هاي سريع در ازدياد انبوه بادرنجبويه مي‌باشد.
* بادرنجبويه در محيط کشت همواره در دسترس براي اعمال هر گونه اعمال تيمار از قبيل جهش مي‌باشد.
* ايجاد جهش تا چه ميزاني مي‌تواند بر روي مواد موثره و ميزان اسانس تغيير ايجاد نمايد.

1-1-3 اهداف پژوهش
در اين پژوهش تلاش مي شود اهداف زير دنبال شود
*آشنايي با تکنيک کشت بافت گياه دارويي بادرنجبويه و تکثير آن در داخل شيشه.
* انتخاب بهترين و مناسب‌ترين نوع از انواع مخيط‌هاي مختلف کشت بافت
* بدست آوردن مقدار قابل توجه گياه در حال رشد براي اعمال جهش نقطه‌اي در بادرنجبويه.
*بررسي تغييرات در خصوصيات مورفولوژيکي پس از اعمال جهش در گياه بادرنجبويه.
* بررسي تغيير در ميزان مواد موثره گياه در غلظت‌هاي مختلف ماده جهش‌زاي EMS

1-1-4 ساختار پژوهش
پژوهش حاضر در پنج فصل ارائه شده است. در فصل اول بيان کلي مسئله، هدف پژوهش و دلايل اهميت موضوع، گياه شناسي بادرنجبويه و خصوصيات مختلف آن مي‌پردازد. همچنين مباحث مربوط به کشت بافت، تاريخچه و کاربرد آن و فاکتورهاي موثر در کشت بافت به دقت مورد بررسي قرار مي‌گيرد. در ادامه، مطالب مربوط به ايجاد جهش و اسانس‌گيري آن مطرح شده و در اين ميان به پژوهش‌هاي پيشين نيز اشاره خواهد شد.
فصل دوم شامل مروري بر تحقيقات و کارهاي پژوهشي انجام شده در رابطه با کشت بافت و اعمال موتاژن‌ها بر روي گياهان است.
فصل سوم شامل مواد و روش‌هاي مورد استفاده در پژوهش از جمله چگونگي ساخت محيط کشت MS و ويژگي‌هاي هر کدام از مواد مورد استفاده دراين محيط است. همچنين در ادامه به روش ضدعفوني کردن گياه، تهيه ريزنمونه و چگونگي کشت کردن اشاره خواهد شد. روش اسانس‌گيري از گياه نيز در اين فصل مورد بررسي قرار خواهد گرفت.
فصل چهارم به بيان نتايج بدست آمده از محاسبه آناليزهاي آماري نمونه‌هاي کشت شده و تحت تيمار قرار گرفته با غلظت‌هاي مختلف مي‌پردازد.
فصل پنجم شامل چکيده‌اي از نتايج حاصل از اين تحقيق و استدلال و بحث در مورد آنها مي‌باشد و همچنين پيشنهادهايي در مورد کارهاي آتي ارائه مي‌دهد.

1-2 کليات
1-2-1 گياه شناسي

شکل1-1شمائي از گياه کامل بادرنجبويه
Melissa officinalisلاتينlemon balm – bee balmانگليسيبادرنجبويهفارسيحوک، بادروج، حشيشه النحل، ترنجانعربيبابريهنديmelisse – the de franceفرانسويبادرنجبويااردو
بادرنجبويه گياهي علفي و چند ساله با نام علمي Melissa officinalis L. از خانواده نعناعيان lamiaceae که با نام‌هاي فارسي مختلف همچون بادرنگبويه، وارنگ بو، بالنگو، ريحان کوهي، تره خراساني، مفرح القلب مي‌باشد. روي ريزوم‌ها گره‌هاي خاصي وجود دارد. از اين گره‌ها استلون‌ها (ريشه راست) و ساير انشعاب‌هاي ريشه‌اي به رنگ قهوه‌اي روشن خارج مي‌شود. ارتفاع گياه متفاوت است و به شرايط اقليمي محل رويش آن بستگي دارد و بين 50 تا 100 سانتي‌متر مي‌باشد. ساقه مستقيم است ولي به ندرت ممكن است به صورت خوابيده روي زمين قرار گيرد (ساقة گياهان جوان معمولاً به صورت خوابيده رشد مي‌كند). برگ‌ها پهن، تخم مرغي شكل به طول سه تا شش سانتي‌متر و به صورت متقابل روي ساقه قرار مي‌گيرند. برگ‌ها به رنگ سبز تيره هستند، سطح آنها ناصاف و برجستگيهاي متعددي دارند (شکل1-1). گل‌ها در قسمت فوقاني گياه و در ناحيه زاويه برگ‌ها تشكيل مي‌شوند. غنچه‌ها معمولاً زردرنگ هستند كه پس از باز شدن به گلهاي سفيد يا بنفش تبديل مي‌شوند. بذر تخم مرغي شكل و رنگ آن تيره و براق (معمولاً سياه رنگ) است. وزن هزاردانه 6/0 تا 7/0 گرم است (ساري و سيلان12،2002؛ رحيمي نيا، 1387).
براي اين گياه سه زيرگونه Altissima و Inodora ،Officinalis معرفي شده است. از بين زيرگونه‌هاي اين جنس، فقط زيرگونه افيسيناليس داراي ارزش اقتصادي بوده و رايحه‌اي شبيه ليموي تازه از خود متصاعد مي‌كند (باتيارکا و همکاران13،2006).
1-2-2 رويش و تکثير گياه
رويش گياه از طريق بذر به كندي انجام مي‌گيرد. رويش گياهان چند ساله در اوايل بهار پس از گرم شدن هوا آغاز مي‌شود. اندام‌هاي هوايي گياه در زمستان بر اثر سرمازدگي خشك مي‌شوند. در اين حالت ريشه زنده است و از فعاليت خفيفي برخوردار است. گل‌ها اواسط تابستان (اواخر تير – اوايل مرداد) ظاهر مي‌شوند و نكتار زيادي نيز توليد مي‌كنند. بوي معطر گل‌ها باعث جلب حشرات، بخصوص زنبورهاي عسل مي‌شود. تغذية نكتار گل‌ها توسط زنبورها سبب افزايش توليد عسل آنها مي‌شود. ميوة آن از اواسط تابستان (اواخر مرداد) به تدريج مي‌رسد. پس از رسيدن، دانه‌ها به اطراف پراكنده مي‌شوند (اميدبيگي، 1384،1386).
1-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار
اين گياه بومي جنوب اروپا، آسياي صغير و بخش‌هاي جنوبي آمريكاي شمالي است. جمعيت‌هاي بادرنجبويه در تمام كشورهاي مديترانه‌اي شامل مناطق ساحلي تركيه و شمال ايران و بخش‌هاي جنوبي آمريكايي شمالي پراكندگي دارند (اميدبيگي،1386؛ آديني و همکاران14،2008).
پيشينه كاشت بادرنجبويه به 2000 سال مي‌رسد و در سراسر اروپا، قفقاز، ايران، ترکمنستان، دامنه‌هاي معتدل هيماليا، هندوستان، مولداويا، اندونزي و امروزه در سراسر جهان كشت مي‌شود (زرگري، 1368-1380).
1-2-4 نيازهاي اکولوژيکي
بادرنجبويه در طول رويش به هواي گرم و نور كافي نياز دارد. بذرها در دماي 10 تا 12 درجة سانتي‌گراد جوانه مي‌زنند، ولي دماي مناسب براي جوانه‌زني 18 تا 20 درجه سانتي‌گراد است. درجة حرارت مطلوب در طول رويش اين گياه 20 تا 22 درجة سانتي‌گراد است. بادنجبويه براي مدتي قادر به تحمل درجة حرارت‌هاي پايين (20- تا 25- درجة سانتي‌گراد) مي‌باشد. براي گياهان مسن درجة حرارت‌هاي پايين براي مدت طولاني مضر بوده و تأثير نامطلوبي بر رشد و نمو و همچنين مواد مؤثرة آنها بر جاي مي‌گذارد. ريشة بادرنجبويه نسبتاً طويل است. اين ريشه به جذب رطوبت از اعماق زمين قادر بوده و براي مدتي خشكي را تحمل مي‌نمايد. رويش گياه در سايه نه تنها سبب كند شدن رشد و نمو گياه مي‌شود، بلكه در كاهش كميت و كيفيت اسانس آن نيز مؤثر است. بادرنجبويه در هر نوع خاكي قادر به رويش مي‌باشد، و خاك‌هايي با بافت متوسط و غني از تركيبات كلسيم و مواد و عناصر غذايي، براي رويش اين گياه بسيار مناسب است. بادرنجبويه قادر است خشكي را براي مدتي تحمل كند. ولي كم آبي و خشكي‌هاي طولاني سبب خشك شدن آن مي‌شود. در هر دورة آبياري گياهان 30 تا 40 ميلي‌متر بايد آبياري شوند، PH خاك براي بادرنجبويه 8/4 تا 8 مناسب است (باقري و همکاران،1384؛ رحيمي نيا،1387).
1-2-5 اهميت دارويي
از مواد مؤثرة اين گياه ، داروهايي براي درمان ناراحتي‌هاي عصبي و همچنين داروهايي براي مداواي بيماريهاي معده ، قلب و روده‌اي كه منـشأ عصبي دارنـد تهيـه مي‌شود. نيرودهنده و ضدتشنج است و به عنوان مقوي معده، بادشكن، تسهيل عمل هضم و معرق و اسانس آن خاصيت آرام كننده با اثر قاطع است. در رفع دلپيچه ناشي از نفخ، درد معده با منشأ عصبي، اختلالات هضمي، طپش قلب سرگيجه و سنكوب بي‌خوابي، ضعف قلب، احساس صداي مبهم در گوش، نزله‌هاي مزمن برونش‌ها، و لوسيون حاصل از دم كرده‌ي آن يا گرد سرشاخه‌ها روي زخم‌ها و جراحات و دردشان را تسكين و مالش دادن جوشانده آن باعث از بين رفتن دردهاي صورت مي‌شود (فيالوا و همکاران15،2008؛ يلديز، 1387). در برخي كشورها از تنتور بادرنجبويه به عنوان آرام بخش استفاده مي‌شود. مواد مؤثرة بادرنجبويه به همراه مواد مؤثرة سنبل الطيب اثر درماني يكديگر را تشديد مي‌كنند.

1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس
برگ داراي يك ماده تلخ، تانن، كامفز، مواد رزيني+ قندهاي مختلف و اسانس است كه از تركيبات اسانس آن سيترونلال و سيترال، ژرانيول، لينالول، استات اوگنول و اسيد رزماري و فنوليك و فلاونوئيد است. در روغن فرار آن مونوترپنها سيترونلال، سيترال، كمي متيل سترونلات اُسيمن، سترونلول، سزكوئي‌ترپن‌ها كاريوفيلين و ژرماكرن است (بيسيت و ويچل16،2001؛ بلومنتال و همکاران17،2000 ؛ اوانس18،2002). اسانس موجود در برگ اين گياه داراي اثرهاي ضد ميكروبي، ضد باكتريايي، ضد ويروسي و هضم كنندگي است و در درمان اختلالات و ناراحتي‌هاي عصبي و بي‌نظمي‌هاي مربوط به معده و روده در سطح وسيعي مورد استفاده قرار مي‌گيرد (فيالوا و همکاران،2008).

1-2-7 استفاده‌ها
اسانس بادرنجبويه در صنايع غذايي و صنايع آرايشي و بهداشتي كاربرد زيادي دارد. از بادرنجبويه مي‌توان به عنوان عطر چاي و همچنين به عنوان طعم دهندة ساير داروها استفاده كرد. اگر چشم‌ها را با دم‌کرده بادرنجبويه (پس از صاف کردن آن) بشويند در تقويت چشم مؤثر است. دم‌کرده 5 درصد بادرنجبويه که طعم و عطر خيلي مطبوعي دارد در رفع بي‌خوابي کودکان و پيران نتايج خيلي خوبي داده است. جويدن آن دهان را خوشبو مي‌كند و جوشانده آن براي استحكام لثه و دندان‌ها مفيد است (اميدبيگي،1384).
1-2-8 کشت بافت گياهي
به رشد مواد گياهي عاري از ميکروب در شرايط عاري از ميکرو ارگانيسم ها مانند محيط غذايي استريل در يک لوله آزمايش، کشت بافت گياهي اطلاق مي‌شود و شامل کشت پروتوپلاست، سلول، بافت و اندام گياهي مي باشد. اين تکنولوژي با نظريه پردازي دانشمند آلماني، هابرلنت در مورد توانايي تبديل يک سلول به موجود کامل در اوايل قرن بيستم شروع شد. هابرلنت پيشنهاد کرد که فنوني جهت جداسازي و کشت بافت ايجاد شود و ادعا کرد که اگر محيط و تغذيه سلول‌هاي کشت شده تنظيم شود اين سلول‌ها مي توانند گياهان نرمالي را به وجود آورند.

در يک موجود زنده پرسلولي اعم از گياهي و جانوري بسياري واحد ساختماني يعني سلول وجود دارد که به طور بالقوه داراي ژن‌هاي سازنده يک موجود کامل پرسلولي ديگر مي‌باشد و بسته به شرايط محيطي و هورموني و غيره مي‌توانند تمايز پيدا کرده و بافت‌ها و اندام‌هاي مختلفي توليد کنند و يا اينکه به صورت بي شکل باقي بمانند. بنابراين هر قسمت از يک گياه ممکن است در شرايط مناسب و ويژه بتواند يک جنين و يک گياه کامل ايجاد کند. از جمله پايه گذاران اين علم ترکول است که در سال 1850 متوجه شد چنانچه قسمتي از ساقه گياه کاکائو زخمي شود يک توده غير متمايز در محل زخم تشکيل مي‌شود که براي اولين بار به آن کالوس يا توده سلولي تمايز نيافته گفته شد(ملايري، 1375).
برخلاف سلول‌هاي جانوري، سلول گياهي حتي در مراحل پيشرفته بلوغ و تمايز، در صورتي‌که سيستم غشائي و هسته آن سالم و فعال باشد، توانائي تغيير به حالت مريستمي و نمو به گياه کامل را دارد. ايده انجام آزمايشات با استفاده از بافت‌ها و اندام‌هاي مجزا شده گياهان تحت شرايط آزمايشگاهي کنترل شده، در اواخر قرن نوزدهم مطرح شده و در تحقيقات هابرلند بيان گرديده است (ملايري، 1375). در سال 1961 روش استفاده از آگار در پتري ديش معرفي شد. در اين روش سلول‌هاي تکي را با آگار گرم شده مخلوط و حاصل را در پتري ديش به صورت يک لايه نازک پهن مي‌کردند. اين موضوع که يک سلول منفرد توانائي تقسيم و تکثير داشته و نهايتا مي‌تواند به يک گياه کامل تبديل شود در سال 1965 اعلام شد (افشاري‌پور، 1372؛ احسان پور،1380).
اولين کشت موفقيت آميز بافت هاي گياهي توسط وايت در سال 1934 انجام شد. در سال 1939 وايت اولين کشت موفقيت آميز کالوس هويج و توتون را گزارش کرد. در سال 1957 يک مقاله کليدي توسط اسکوگ و ميلر منتشر شد. در آن مقاله آن ها اظهار داشتند که اثرات متقابل بين مقدار اکسين ها و مقدار سيتوکنين ها تعيين کننده نوع رشد و تغييرات ريخت شناختي مي باشد(تاجي و همکاران، 1382).
مزيت تكثير از طريق كشت بافت نسبت به ساير روش‌هاي مرسوم، توليد تعداد زيادي گياه با محتواي ژنتيكي يكسان و كيفيت يكنواخت، در زمان كوتاه‌تر و فضاي نسبتاً محدود مي‌باشد(ساتيش و باوان اندان19، 1988 ؛ مانتل و هوگو20، 1989 ؛ باسو و چاند21، 1996 ؛ شاساني و همکاران22، 1998).

در کشت بافت گياهي بيشتر اوقات يک ريز نمونه23 را براي شروع رشد در محيط کشت مصنوعي قرار مي‌دهيم سلول‌هاي غير فعال ، تمايز يافته24 و تقسيم نشده و ريزنمونه در حين رشد در محيط غذايي ابتدا متحمل تغييراتي براي وارد شدن به حالت مريستمي مي‌شوند (آدام و وندل25، 2005). پديده بازگشت سلول‌هاي بالغ به مرحله مريستمي و شکل‌گيري بافت کالوس را تمايززدايي مي‌نامند. از آنجا که ريزنمونه چند سلولي، متشکل از انواع مختلفي از سلول‌ها مي‌باشد بنابراين سلول‌هاي بافت کالوس نيز هتروژن خواهند بود. توانايي سلول‌هاي بافت کالوس براي تمايز يافتن به يک گياه کامل و يا يک اندام گياهي را تمايز مجدد26 مي‌نامند. اين دو پديده يعني خارج شدن از حالت تمايز با تمايززدايي و تمايز مجدد از ظرفيت‌هاي ذاتي سلول‌هاي گياهي هستند و تکامل آنها به گياه کامل به عنوان توتي‌پتانسي27 توصيف مي‌گردد. عموما قبل از اينکه سلول‌ها بتوانند وارد تمايز مجدد شده و گياه کامل توليد نمايند مرحله کالوس را بايستي بگذرانند (والن زوئلا و همکاران28،1986 ؛ فارسي و ذوالعلي،1382).
همچنين استفاده از راه‌كارهاي فناوري زيستي از جمله كشت سوسپانسيون سلولي، كشت اندام (كشت ريشه هاي موئين و ساقه) راه حلي مناسب براي توليد سريع و انبوه متابوليت‌هاي ثانويه مي‌باشد (پزوت29، 1996؛ راو و راويش انکار30، 2002؛ بورگاد و همکاران31، 2002 ؛ مولاباگال و تساي32، 2004).
يکي از بخش‌هاي مهم بيوتکنولوژي، کشت بافت است که کاربردهاي مختلف آن در زمينه گياهان داروئي، از جنبه‌هاي مختلفي قابل بررسي است.

1-2-8-1تاريخچه کشت بافت گياهي
در سال‌هاي اخير تکنيک‌هاي کشت بافت گياهي به يک ابزار خيلي قوي براي تکثير و اصلاح گونه‌هاي گياهي زيادي تبديل شده‌اند. اين تکنولوژي با پژوهش گتليب هابرلند33 در مورد پرتواني سلول در اوايل قرن 20 شروع شد. وي با توجه به اين نکته که با دستکاري محيط کشت سلول‌ها ، سلول‌هاي کشت شده مراحل نموي يک رشد عادي را تکرار خواهند نمود،پيشنهاد گسترش تکنيک‌هاي جداسازي و کشت بافت‌هاي گياهي را ارائه داد.
کشف اکسين‌ها توسط ونت و همکاران34 و کشف سيتوکينين‌ها توسط اسکوگ و همکاران قبل از اولين کشف موفق بافت‌هاي گياهي در آزمايشگاه صورت گرفت (افشاري پور 1372 ).
اولين کشت موفق کالوس هويج و توتون توسط وايت در سال 1943 گزارش گرديد. اسکوگ و ميلر نيز در سال 1957 گزارش کردند که اثر متقابل کمي بين اکسين‌ها و سيتوکينين‌ها نوع رشد و ريخت‌زايي گياه را تعيين مي‌کند. مطالعات آنها بر روي توتون نشان داد که نسبت بالاي اکسين به سيتوکينين، ريشه‌زائي را تحريک نموده و پايين بودن اين نسبت، باعث تحريک تشکيل اندام هوائي مي‌شود اما اين پاسخ، عمومي نيست.با اين که دستکاري نسبت اکسين و سيتوکينين در ريخت‌زائي گونه‌هاي زيادي موفقيت آميز بوده است، اما امروزه واضح است که عوامل زياد ديگري بر توانائي سلول‌ها در کشت براي تمايز ريشه، اندام هوائي يا رويا موثر است (افشاري پور 1372).
ايجاد انگيزه براي بکارگيري تکنيک‌هاي کشت بافت گياهي در تکثير و اصلاح گونه‌هاي گياهي از کار اوليه مورل و موراشيگ روي تکثير ارکيده در محيط کشت و تهيه يک محيط کشت جديد با غلظت بالائي از نمک هاي معدني توسط موراشيک و اسکوک ناشي شد. از آن به بعد به صورت قابل توجهي رشد يافت و امروزه يک نقش کليدي در تکثير، اصلاح و مهندسي ژنتيک گياهي ايفاء مي‌کند.
1-2-9کاربردهاي کشت بافت گياهي
1-2-9-1 توليد مواد شيميايي
گياهان به عنوان منبع مهمي از مواد پيشتاز فرآورده‌هايي که در صنايع مختلف مانند داروسازي، صنايع غذايي و آرايشي و بهداشتي و کشاورزي مورد استفاده‌اند (هيناستين و مري35 1988).
1-2-9-2 ايجاد گياهان عاري از عوامل بيماري‌زايي گياهي
غلات ممکن است توسط گونه‌هاي زيادي از آفات ميکروبي، ويروس، باکتريائي و قارچي آلوده مي‌شوند. اين آلودگي‌ها تا حد زيادي موجب کاهش توليد فرآورده کيفيت آن و توان گياه مي‌شوند. آلودگي در درختان ميوه بازده محصول را تا 90% کم مي‌کند. اساس به دست آوردن گياهان بدون ويروس کشت مريستم انتهايي آنهاست با کشت قطعه کوچکي از مريستم مي‌توان کالوس بدون ويروس تهيه کرد (هيناستين و امري 1988).
1-2-9-3 ايجاد تنوع ژنتيکي
مواد گياهي که از طريق کشت بافت تکثير مي‌شوند تغييرات ژنتيکي بالايي را نشان مي‌دهند. زماني که از کشت کالوس مرتبا زير کشت گرفته شود گياهان حاصل سطح پلوئيدي متفاوتي را نشان مي‌دهند و همين تغييرات ناشي از کشت بافت مي‌تواند تنوع ژنتيکي جديدي را در اختيار اصلاح کننده نباتات قرار دهد (هيناستين و امري 1988)
1-2-9-4 کاربرد کشت بافت گياهي در کشاورزي،باغباني و جنگلداري
از اوايل دهه 1970 با توسعه فنون کشت آزمايشگاهي و ابداع روشهاي جديد بيولوژي مولکولي، کشت بافت و سلول گياهي تأثير چشم‌گيري در هر دو زمينه اصلاح نباتات و تکثير رويشي (ريزازديادي) داشته و ذخيره و نگهداري ذخاير توارثي را تسهيل کرده است. از طرف ديگر، کشت بافت گياهي بخش جدايي ناپذير فناوري تراريختي گياهان است که با استفاده از آن توليد گياهان تراريخته با انتقال DNA از منابع مختلف امکان پذير ميشود. به مجموعه اين روشها، فناوري زيستي گياهي گفته ميشود که مباحث متنوعي شامل شده و در تحقيقات علمي پايه و همچنين براي مقاصد اقتصادي در زمينههاي کشاورزي، باغباني و جنگلداري کاربرد دارد.

1-2-9-5 کاربردهاي اقتصادي کشت بافت گياهي
ريزازديادي يکي از روشهاي کشت بافت است که از آن براي ايجاد تعداد زيادي گياه مشابه از يک گياه مادري استفاده ميشود. مزيت مهم ازدياد اين است که از طريق آن ميتوان بسيار سريعتر از روشهاي سنتي تعداد زيادي گياه مشابه توليد کرد. اين روش مخصوصاً در دست‌ورزي ژنتيکي کاربرد زيادي دارد، زيرا از اين طريق ميتوان گياه تراريخته جديد را سريعاً تکثير نمود (عليزاده، 1390).
با استفاده از ريزازديادي بيش از 10 هزار گونه گياهي با موفقيت توليد شدهاند. بسياري از اين گونهها زينتي هستند، با اين وجود اين روش براي گياهان زراعي و درختان ميوه نيز مورد استفاده قرار ميگيرد. استفاده از اين روش در بعضي از شرايط خاص بسيار مفيد است. اولاً در گونههايي که تکثير رويشي در آنها مشکل است و يا گونههايي که بذر سرسخت دارند (يعني به سختي جوانه ميزنند) که از آن جمله ميتوان به گونههاي زينتي مانند ارکيده اشاره کرد. مورد دوم شامل موقعي است که آميزش گياهان و ازدياد از طريق بذر، سرعت تکثير گياه را کاهش داده و براي مثال در گونههاي درختي موجب به وجود آمدن تنوع ژنتيکي ناخواسته مي‌شود. سومين مورد، کاربرد ريز ازديادي براي تکثير گياهاني است که بعضي از بيمارهاي ساختاري در آن‌ها از طريق روشهاي سنتي تکثير منتقل ميشود ولي از طريق ريزازديادي مريستم يا بافتهاي ديگر امکان انتقال آنها وجود ندارد (افشاري پور 1372).

1-2-9-6 کاربردهاي کشت بافت گياهي در مهندسي ژنتيک و فناوري زيستي
کشت بافت گياهي جزئي ضروري براي کارهاي مهندسي ژنتيک و ايجاد گياهان تراريخته با خصوصيات جديد است. در بيشتر سال‌هاي قرن بيستم، آميزش گياهان روشي معمول براي توليد گياهان زراعي با صفات مطلوب بوده است. با آميزش گياهان انتخابي ژن‌هاي مطلوب دو يا چند فرد با هم ترکيب شده به طوري که دورگ حاصل داراي ترکيبي از صفات مطلوب خواهد بود.
با گسترش کشت بافت گياهي و روش‌هاي جديد زيست شناسي مولکولي، امکان تبادل DNA بين موجودات غير خويشاوند نيز فراهم شده است، به طوري که مي‌توان ژن‌هاي جديدي را از موجودات خارج از سلسله‌ي گياهان به آنها وارد کرد. علاوه بر اين، تغيير ژنوم گياهي از طريق معرفي و بيان DNA بيگانه (مهندسي ژنتيک)، منجر به ايجاد ژنوتيپ‌هاي جديدي (گياهان تراريخته) مي‌شود که مي‌توان با استفاده از روش‌هاي اصلاح سنتي به اصلاح و بهبود بيشتر آنها کمک نمود.(هيناستين و امري 1988)
1-2-9-7 انواع کشت بافت گياهي
تکنيک‌هاي انواع کشت بافت گياهي را مي‌توان عمدتا به پنج دسته



قیمت: تومان


پاسخ دهید